Dokument: Dynamic quantitative determination of intracellular sodium with fluorescence lifetime imaging

Titel:	Dynamic quantitative determination of intracellular sodium with fluorescence lifetime imaging
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56661
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220706-085234-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M. Sc. Meyer, Jan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,73 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.06.2021 / geändert 23.06.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Christine R. Rose [Gutachter] Prof. Dr. Christoph Fahlke [Gutachter] Prof. Dr. Eilers, Jens [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Brain activity is accompanied by intracellular sodium (Na+) transients, which have been observed under many pathological conditions including ischemic stroke or epilepsy. Recovery from these Na+-elevations is mainly mediated by the Na+ / K+-ATPase (NKA) consuming energy in the form of Adenosine Triphosphate (ATP). In this study, we evaluate the relationship between global and local neuronal Na+-signalling and ATP consumption in acute brain tissue slices of mice. Utilizing Na+ imaging and a genetically encoded ATP nanosensor, this study was able to show that global increases in the intracellular Na+-concentration ([Na+]i) result in transient decreases in intracellular ATP ([ATP]i). In contrast, local Na+-elevations were not accompanied by changes in [ATP]i. These findings suggest, while recovery after global increases in Na+ can temporarily surpass the cellular energy production, energy demand after local Na+-transient can be encountered by ATP diffusion and production from unstimulated regions. Alongside increases in [Na+]i, neuronal activity is accompanied by the efflux of K+. The released K+ is taken up by astrocytes and redistributed through gap junctions in the astrocytic syncytium. In this study, intensity-based fluorescent indicators and K+-microelectrodes were used to identify a relationship between astrocyte gap junction uncoupling and the intensification of epileptic seizures. The study at hand shows, that after brief epileptiform activity K+-uptake as well as spread via astrocytic gap junctions is reduced. We were able to identify Na+, 2-HCO3-- Co-transporter (NBC) mediated alkalization as a potential cause for gap junction uncoupling and thereby identify a possible treatment against seizure intensification. The study of these changes, was mainly performed employing fluorescent indicator dyes combined with intensity-based imaging. However, the latter can be impaired under conditions accompanied by cellular swelling (e. g. during ischemia), as changes in dye concentration interfere with proper ion quantification. To this extent, this study introduces Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) in combination with two Na+ indicator dyes as new tools to investigate the [Na+]i, independent from the dye concetration. Employing FLIM with CoroNa Green (CoroNa) revealed significant compartmentalization of Na+ concentrations inside human embryonic kidney (HEK) cells. However, the temporal resolution in classical FLIM (80-120 s per image) is limited by so-called dead-time artefacts, which reduce the number of usable photons. In the present study, a combination of the Na+-indicator ION NaTRIUM Green-2 (ING-2) with a new approach, called rapidFLIM, which exhibits a drastically reduced dead-time of only ~0.5 ns was investigated. The combination of rapidFLIM with ING-2 increased the possible temporal resolution > 40 fold full frame (2 s per image) and made the first measurements of [Na+]i under severe metabolic inhibition, which is accompanied by major cellular swelling possible. The inhibition of TRPV4 channels lead to a reduction of the Na+ influx and nearly completely abolished cellular swelling under severe ischemic conditions. My work showed that the combination of rapidFLIM and ING-2 is able to identify rapid changes in [Na+]i under challenging pathophysiological conditions. Furthermore, rapidFLIM will set the stage for faster and more sensitive lifetime-based imaging with a wide variety of applications. Gehirnaktivität wird von intrazellulären Natriumtransienten begleitet, welche ebenfalls unter vielen pathophysiologischen Bedingungen (z.B. während Schlaganfall und Epilepsie) nachgewiesen werden konnten. Die Rückführung dieser Signale wird durch die Na+/K+-ATPase, unter Verbrauch von Adenosine Triphosphate (ATP) bewerkstelligt. In der vorliegenden Studie wurde der Zusammenhang zwischen globalen und lokalen Na+-Transienten und dem Verbrauch von ATP durch die NKA untersucht. Dabei wurde Na+-sensitive Bildgebung und ein genetisch exprimierter ATP Sensor in Gewebeschnitten des Mausgehirns verwendet. Hierbei konnte eine Reduktion der ATP-Konzentration nach globalen, jedoch nicht nach lokal begrenzten Na+-Signale nachgewiesen werden. Neuronale Aktivität wird auch von einem Efflux von Kaliumionen (K+) begleitet, die wiederum von Astrozyten aufgenommen und durch so genannten Zell-Zell-Kanäle im astrozytären Synzytium verteilt werden. In dieser Studie wurde eine Beziehung zwischen dem Entkoppeln von astrozytären Zell-Zell-Kanälen und der Verstärkung epileptischer Anfälle untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass selbst nach kurzweiliger Induktion epileptischer Aktivität die astrozytenvermittelte Kaliumaufnahme, sowie Verteilung im Synzytium vermindert ist. Als möglicher Grund für das Auflösen der Zell-Zellverbindungen wurde der Na+-Bicarbonat-Cotransporter identifiziert, welcher zu einer Alkalisierung von Astrozyten führte. Alle bisher erwähnten Studien stützen sich auf die Kombination fluoreszierender Farbstoffe mit intensitätsbasierten Verfahren. Letztere reagieren auf Änderungen der Farbstoffkonzentration und können daher nur vermindert für die Quantifizierung von Ionen während zellulärem Schwellen (z.B. während eines Schlaganfalls) eingesetzt werden. Die vorliegende Studie erforscht die Messung von intrazellulären Na+-Konzentrationen [Na+]i basierend auf der Fluoreszenzlebensdauer Mikroskopie (FLIM), die unabhängig von der Farbstoffkonzentration ist. Durch die Verwendung von CoroNa Green konnte hier eine subzelluläre Kompartimentierung der [Na+]i von menschlichen Zellen der Niere (HEK) nachgewiesen werden. Zeitlich betrachtet ist FLIM eine eher langsame Technik (80-120 s pro Bild). Die hier erbprobte Methode, rapidFLIM verbesserte mit dem Indikator ION NaTRIUM Green 2 die zeitliche Auflösung um ca. Faktor 40 (2s pro Bild). Zusätzlich ermöglichte rapidFLIM erstmals die Messung der [Na+]i nach schwerer metabolischer Inhibition, welche von starkem zellulären Schwellen begleitet wird. Zusammengefasst zeigt meine Arbeit, dass die Kombination aus rapidFLIM mit Na+-sensitiven Farbstoffen rapide Veränderungen der [Na+]i darstellen kann und das Messen auch während schwerem zellulären Schwellen ermöglicht. rapidFLIM ebnet den Weg für sensitivere, lebensdauerbasierte Messungen bei einer breiten Menge möglicher Anwendungen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Neurobiologie
Dokument erstellt am:	06.07.2022
Dateien geändert am:	06.07.2022
Promotionsantrag am:	02.02.2021
Datum der Promotion:	09.06.2021