Dokument: Stabilisierung der nativen Konformation der humanen Superoxiddismutase 1 mittels Peptidliganden zur ALS-Therapie

Titel:	Stabilisierung der nativen Konformation der humanen Superoxiddismutase 1 mittels Peptidliganden zur ALS-Therapie
Weiterer Titel:	Stabilization of the native human superoxide dismutase 1 by peptide ligands for ALS treatment
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56629
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210624-104224-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Santur, Karoline Bianka [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,42 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.06.2021 / geändert 20.06.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	hSOD1, ALS, Phagendisplay, Peptidliganden
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankung, die durch den Verlust motorischer Neuronen gekennzeichnet ist. Die Überlebenszeit der Betroffenen beträgt in der Regel 3 bis 5 Jahre nach Ausbruch der ersten Symptome. Bislang stehen lediglich zwei Medikamente, Riluzol und Edavaron, zur Verfügung, die jedoch in ihrer Wirksamkeit insofern begrenzt sind, dass diese die Überlebenszeit der Patienten nur um wenige Monate verlängern. Aus diesem Grund ist es zwingend notwendig, einen neuen Wirkstoff zu entwickeln, der eine kausale ALS-Therapie ermöglicht, wodurch der Krankheitsverlauf nicht nur deutlich verlangsamt, sondern im besten Fall auch vollständig aufgehalten wird. In den vergangenen Jahren wurden vermehrt Mutationen im Gen codierend für die humane Superoxiddismutase 1 (hSOD1) identifiziert, die mit der ALS-Pathogenese assoziiert sind. In der Regel liegt hSOD1 als stabiles, dimeres Enzym mit verschiedenen posttranslationalen Modifikationen vor. So sind neben der Dimerisierung sowohl die Ausbildung einer intramolekularen Disulfidbrücke als auch die Insertion von Metallionen für die katalytische Aktivität und Stabilität des Proteins essentiell. Einige ALS-assoziierte Mutationen und/oder destabilisierende Faktoren begünstigen jedoch eine Fehlfaltung des Proteins, wobei der zugrunde liegende Pathomechanismus bisher nicht eindeutig identifiziert ist. Bisherige Studien weisen auf einen toxischen Funktionsgewinn von hSOD1 als Resultat der Proteinfehlfaltung und -aggregation hin. Die Tatsache, dass Aggregate bestehend aus fehlgefalteter, wildtypischer hSOD1 nicht nur bei Patienten mit familiärer ALS (fALS), sondern auch bei Patienten mit sporadischer ALS (sALS) sowie in einigen fALS-Fällen mit keiner vorliegenden SOD1-Mutation gefunden worden sind, lässt vermuten, dass die hSOD1-Fehlfaltung ein gemeinsamer Bestandteil des ALS-Pathomechanismus ist. Aus diesem Grund stellt die Stabilisierung der nativen Konformation von hSOD1 mittels Peptidliganden einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung aller hSOD1-assoziierten ALS-Formen dar mit dem Ziel, die Bildung von toxischen hSOD1-Spezies zu reduzieren, wenn nicht sogar vollständig zu inhibieren. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden Peptide mittels Phagendisplay identifiziert, die native hSOD1 binden und die einen Einfluss auf die hSOD1-Aggregation besitzen. Hierfür wurde zunächst ein Rekonstitutionsprotokoll mit der Verwendung von verschiedenen Methoden zur abschließenden Charakterisierung der rekonstituierten hSOD1 bezüglich der Konformation, Stabilität und Aktivität etabliert, welches die Herstellung von nativ gefalteter, rekombinanter hSOD1 mit der bisher höchsten publizierten enzymatischen Aktivität und mit nahezu vollständiger Metallionenbeladung ermöglichte. Die nachfolgende Durchführung des Phagendisplay und die Einführung von geeigneten Kontrollselektionen, sowie die Analyse der resultierenden Proben mittels Next Generation Sequencing (NGS) und der in der Arbeitsgruppe Mohrlüder entwickelten Software Target Sequencing Analysis Tool (TSAT) führten anschließend zur Identifizierung von hSOD1-Peptidliganden. Insbesondere für das hier identifizierte Peptid S1VL 21 konnte eine mikromolare Bindungsaffinität zu nativer hSOD1 und ein konzentrationsabhängiger, reduzierender Einfluss auf die Bildung von hSOD1-Aggregaten in vitro gezeigt werden. Erste Analysen deuteten zudem darauf hin, dass die mit S1VL 21 inkubierten und nach Aggregation verbliebenen hSOD1-Spezies auch in ihrer Größe reduziert sind und eine geringere Toxizität in Zellen aufweisen als Peptid-unbehandelte hSOD1-Aggregate. Die sequenzspezifische Wirksamkeit von S1VL 21 konnte ferner mit Hilfe von randomisierten Kontrollpeptiden, die eine geringere Bindungsaffinität zu nativer hSOD1 und kaum bis gar keinen Einfluss auf die hSOD1-Aggregation besitzen, demonstriert werden. Zusammengefasst liefert die hier vorliegende Arbeit nicht nur wichtige Bausteine zur Identifizierung von hSOD1-bindenden Peptiden, sondern auch erste wichtige Daten bezüglich einer potentiellen Leitsubstanz für die Entwicklung von hSOD1 assoziierten Therapeutika für die Behandlung von ALS. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by the progressive degeneration of motor neurons. Death occurs typically within 3 to 5 years after symptom onset. Only two drugs, riluzole and edavarone, are currently available, that extend survival by only few months. Therefore, it is necessary to develop a new effective compound that enables a causal ALS therapy resulting in a significant deceleration or even in a total prevention of disease progression. In the past few years, mutations in the gene coding for the human superoxide dismutase 1 (hSOD1) have been increasingly identified that are linked to ALS pathogenesis. Usually, hSOD1 exists as a stable, dimeric enzyme with several posttranslational modifications. Besides dimerization, both the formation of an intramolecular disulphide bridge and the insertion of metal ions are important for protein stability and activity. However, some ALS-associated mutations and/or destabilizing factors promote misfolding and aggregation of hSOD1, whereas the underlying pathomechanism is still unclear. Some studies suggest a toxic gain of function of hSOD1 as a result of protein misfolding and aggregation. Interestingly, aggregates containing misfolded wild type hSOD1 have been found not only in patients with familial ALS (fALS) but also in patients with sporadic ALS (sALS) and in some fALS cases without SOD1 mutation leading to the hypothesis that hSOD1 misfolding is a common part of the ALS pathomechanism. Thus, stabilizing the native conformation of hSOD1 by specifically binding peptide ligands to reduce or completely inhibit the formation of toxic hSOD1 species may be a promising approach for hSOD1-related ALS therapy. In the present work, peptides were identified by phage display that bind native hSOD1 and interfere with hSOD1 aggregation. For this purpose, a reconstitution protocol was established, which allowed the preparation of natively folded recombinant hSOD1 with the highest enzymatic activity published so far and with almost complete metalation level. Therefore, several methods were used to characterize reconstituted hSOD1 regarding its conformation, stability, and activity. Subsequent phage display including control selections and the analysis of resulting samples by next generation sequencing (NGS) as well as by the target sequencing analysis tool (TSAT) – a software that was developed in the research group Mohrlüder – led to the identification of hSOD1 peptide ligands. Especially one identified peptide, S1VL 21, revealed a micromolar binding affinity to native hSOD1 and a concentration-dependent reducing impact on the in vitro formation of hSOD1 aggregates. Preliminary analyses suggested that hSOD1 species resulting from the incubation with S1VL 21 under hSOD1-aggregating conditions are also reduced in size and exhibit lower toxicity in cell culture experiments than non-treated hSOD1 aggregates. The sequence-specific efficacy of S1VL 21 was further demonstrated by using randomized control peptides with lower binding affinity to native hSOD1 and less or none influence on the formation of hSOD1 aggregates. In summary, this work provides not only important tools for the identification of hSOD1-binding peptides, but also first important data on a potential lead compound for the development of hSOD1-associated drugs for ALS treatment.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	24.06.2021
Dateien geändert am:	24.06.2021
Promotionsantrag am:	18.03.2021
Datum der Promotion:	11.05.2021