Dokument: Identifizierung einer neuen Rrm4-abhängigen Komponente des endosomalen mRNA-Transports in Ustilago maydis
| Titel: | Identifizierung einer neuen Rrm4-abhängigen Komponente des endosomalen mRNA-Transports in Ustilago maydis | |||||||
| Weiterer Titel: | Identification of a novel Rrm4-dependent component of the endosomal mRNA transport in Ustilago maydis | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56518 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210616-103550-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Tulinski, Markus [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | mRNA-Transport | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Der Transport von mRNAs und deren lokale Translation spielen in eukaryotischen Zellen eine wichtige Rolle für eine Vielzahl von zellulären Prozessen, wie polarem Wachstum oder der Instanthaltung von Mitochondrien. Die mRNAs werden hierbei durch RNA-bindende Proteine gebunden und als messenger-Ribonukleoprotein (mRNP) -Komplex Membran-gekoppelt aktiv entlang des Cytoskeletts transportiert. Der endosomale mRNA-Transport wurde zum ersten Mal in dem phytopathogenen Pilz Ustilago maydis beschrieben. Hierbei wird die mRNA durch einen, an frühe Endosomen gekoppelten mRNP-Komplex entlang des Mikrotubuli-Cytoskeletts transportiert. Die entscheidende Rolle spielt hierbei das RNA-bindende Protein Rrm4, welches durch das Adapterprotein Upa1 an die Membran des frühen Endosoms verankert wird. Obwohl bereits einige weitere Komponenten identifiziert werden konnten, ist die genaue Komposition des mRNP-Komplexes unbekannt. Derzeit werden noch andere Komponenten vermutet, die zur Funtion und Regulation des endosomalen mRNA-Transports beitragen.
In dieser Arbeit wurden zwei proteinzentrische Methoden angewendet, um weitere Proteine des endosomalen mRNP-Komplexes zu identifizieren. Zum einem wurde versucht, die APEX2-vermittelte unspezifische Umgebungsmarkierung für eine in vivo-Anwendung in U. maydis zu etablieren. Bei dieser Methode sollten alle Proteine, die sich in näherer Umgebung von Rrm4 befinden, mit Biotin-Phenoxyl markiert werden. Mit Hilfe dieser Markierung könnten so potentielle Interaktionspartner von Rrm4 identifiziert werden. Diese Methode erwies sich jedoch in U. maydis als unzuverlässig. Daher wurde alternativ eine Immunpräzipitation von Rrm4 durchgeführt, bei welcher alle co-immunpräzipitierten Proteine durch eine massenspektrometrische Analyse identifiziert wurden. Diese identifizierte eine Vielzahl potentieller mRNP-Komplex-Komponenten, welche anhand ihrer Funktion und Abundanz gefiltert wurden. Hierbei wurde das Ssd1-Homolog aus Saccharomyces cerevisiae als potentieller Bestandteil des mRNP-Komplexes identifiziert. Ssd1 erwies sich als interessanter Kandidat, da bereits in anderen Pilzen homologe Proteine als RNA-bindende Proteine beschrieben wurden, welche bei der Regulation der Translation eine wichtige Rolle spielen. Lokalisationsstudien zeigten, dass Ssd1-Gfp nahezu vollständig mit Rrm4 auf frühen Endosomen colokalisiert. Zudem erwies sich die endosomale Lokalisation von Ssd1 als Rrm4-abhängig. In Übereinstimmung mit einer möglichen Beteiligung von Ssd1 am hyphalen Wachstum von U. maydis zeigte die Überexpression von Ssd1 starke Auswirkungen auf das polare Wachstum von hyphalen Zellen. Somit wurde in dieser Arbeit Ssd1 als weitere Rrm4-abhängige mRNP-Komplex-Komponente identifiziert, welche wahrscheinlich als regulatorischer Bestandteil, der wiederum durch eine NDR-Proteinkinase reguliert wird, die lokale Translation und dadurch das polare Wachstum beeinflusst.The transport of mRNAs and their local translation play an important role in a multitude of cellular processes in eukaryotic cells, like polar growth and the maintenance of mitochondria. mRNAs are bound by RNA-binding proteins and transported in a membrane-coupled messenger ribonucleoprotein (mRNP) complex along the cytoskeleton. The endosomal mRNA transport has first been described in the plant pathogenic fungus Ustilago maydis. Here the mRNAs are transported along the microtubule cytoskeleton by a mRNP complex which is bound to an early endosome. The RNA-binding protein Rrm4 plays a key role in the endosomal mRNP complex and is anchored by the adapter protein Upa1 to the membrane of the endosome. Although additional components have been successfully identified the excact composition of the mRNP complex is still unknown. Currently it is assumed that there might be more components involved in function and regulation of the endosomal mRNA transport. In this thesis two protein-centric methods have been applied in order to identify novel endosomal mRNP complex proteins. One strategy was to establish APEX2-mediated unspecific proximity labeling for an in vivo application in U. maydis. This method should enable the biotin-phenoxyl labeling of all proteins in close proximity to Rrm4. This labeling could then be utilized to the identify potential Rrm4 interaction partners. However, this method turned out to be in unreliable in U. maydis. Hence as alternative an immunoprecipitation of Rrm4 has been performed in which all co-purified proteins have been identified by mass spectrometry. The results of this experiment yielded a variety of potential mRNP complex components, which have been filtered by their function and abundance. This way the Ssd1 homolog of Saccharomyces cerevisiae has been identified as a potential mRNP complex candidate. Ssd1 proved to be an interesting candidate since its homologs have been already described in other fungi as RNA-binding proteins which play an important role in regulation of translation. Localization studies showed that Ssd1-Gfp co-localizes nearly completely with Rrm4 on early endosomes. Furthermore, it could be shown that the endosomal localization of Ssd1 is Rrm4 dependent. In compliance with a possible involvement of Ssd1 in hyphal growth in U. maydis, an overexpression of Ssd1 had immense impact on the polar growth of hyphal cells. Consequently, this thesis identifies Ssd1 as a novel Rrm4-dependent mRNP complex component, which is likely a regulatory constituent, that is in turn regulated by a NDR kinase, influencing local translation and thereby polar growth. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.06.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.06.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.01.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 19.04.2021 |
