Dokument: Modelling neurological diseases using patientderived induced pluripotent stem cells

Titel:	Modelling neurological diseases using patientderived induced pluripotent stem cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56304
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210611-085157-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Martins, Soraia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 28,99 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.05.2021 / geändert 18.05.2021
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Neurological diseases, ranging from neurodevelopmental to neurodegenerative disorders, affect millions of individuals worldwide. These diseases present an enormous economic, emotional and physical burden to the affected individuals, their families and the society. One of the major obstacles of studying neurological diseases is the inaccessibility to primary brain samples, and in the cases where the tissue is available, primary neurons cannot be maintained and propagated in vitro. While transgenic animal models and immortalized cell lines have been widely used, they do not accurately replicate the human brain physiology, genetics and developmental patterns. Therefore, human models are needed to investigate the underlying molecular mechanisms of these diseases. Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have opened a new avenue to study neurological diseases in an unprecedented way, not only providing excellent tools to identify therapeutic targets, but also giving insights into the underlying molecular mechanism. The use of patient-derived iPSCs overcomes many challenges that are posed from studying complex disease pathways in the brain, which can now be unravelled in a cell-culture dish. The work described in this thesis aimed to employ patient-derived iPSCs to model a neurodegenerative disease, Alzheimer’s disease (AD), and a rare neurodevelopmental disease, Nijmegen Breakage Syndrome (NBS). The generation of iPSCs from late-onset Alzheimer’s disease (LOAD) patients carrying the rare triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) R47H variant and the establishment of iPSC-derived neuronal cultures to model AD are described in chapter 2. We report for the first time the stimulation of the iPSC-derived neuronal cultures with an Amyloid-β (Aβ)-S8C dimer. Through this novel approach, and by employing global transcriptome analysis, we were able to identify metabolic dysregulation, impaired phagocytosis related pathways, altered inflammatory response and endoplasmic reticulum (ER)-stress as the early events underlying LOAD in neurons carrying the TREM2 R47H variant. In another study, we were able to show that amyloid-precursor-protein (APP) processing and Aβ production are controlled by the adaptor protein 2 (AP-2), a complex required for APP endocytosis. We found decreased AP-2 levels in the AD neuronal culture, suggesting cells expressing TREM2 R47H variant might transcriptionally down-regulate AP-2 levels in the brains of AD patients. The new insights from the mechanisms underlying the earlier pathology of AD identified here provide new opportunities for screening of potential therapeutic targets. The use of iPSCs to model NBS, a rare autosomal recessive disorder caused by mutations within (nibrin) NBN, a DNA-damage repair protein, is described in chapter 3. We generated for the first time an NBS-iPSC line carrying the NBN 647del5 mutation employing a non-integrative method. NBS-iPSCs were used to implement 3D cerebral organoids to decipher the molecular mechanisms underlying microcephaly, one of the hallmarks of NBS. We showed that NBS-organoids carrying the homozygous 647del5 NBN mutation are significantly smaller in size than control-organoids and have a disrupted cyto-architecture. NBS patient-derived organoids exhibit premature differentiation together with neuronatin overexpression, and key pathways related to DNA damage response and cell cycle are differentially regulated compared to controls. Moreover, we show that after exposure to bleomycin, a genotoxic agent, NBS-organoids undergo delayed p53-mediated DNA damage response and aberrant trans-synaptic signalling, which ultimately leads to neuronal apoptosis. Our data provide insights into how mutations within NBN alter neurogenesis in NBS patients, thus providing a proof of concept that cerebral organoids are a valuable tool for studying DNA damage-related disorders. Together the work presented in this thesis highlights the tremendous opportunities to address neuronal pathologies using patient-derived iPSCs. Specifically, we proved that iPSCs derived from AD and NBS patients are a powerful platform for evaluation of disease-related phenotypes, opening new avenues for the disease modelling and drug discovery fields. Mehrere Millionen Patienten weltweit leiden unter neurologischen Erkrankungen. Sowohl neuronale Entwicklungsstörungen als auch neurodegenerative Erkrankungen stellen enorme wirtschaftliche, emotionale und physische Belastungen für die betroffenen Patienten, ihre Familien und die Gesellschaft dar. Eines der größten Hindernisse für das Studium von neuronalen Erkrankungen ist die Tatsache, dass es unmöglich ist humane Gehirnbiospien für detaillierte Untersuchungen zu erhalten. Selbst wenn diese zur Verfügung stehen, sind die möglichen Analysen stark eingeschränkt, da primäre Neurone in vitro weder erhalten noch vermehrt werden können. Alternativ stehen Tiermodelle und immortalisierte Zelllinen zur Verfügung, die jedoch weder die humane Hirnphysiolgie, noch die Genetik oder Entwicklungsmuster korrekt widerspiegeln. Daher werden dringend humane Modelle benötigt, die Untersuchungen der molekularen Grundlagen von neurologischen Erkrankungen ermöglichen. Verbesserte Protokolle für die Arbeit mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) und ihre Differenzierung in die neuronale Richtung haben in den letzten Jahren neue Möglichkeiten eröffnet, die molekularen Grundlagen von neurologischen Erkrankungen zu untersuchen und therapeutische Ziele zu identifizieren. Die Verwendung von iPSCs, die aus Patientenzellen generiert wurden, hilft dabei die komplexen Signalwege, die diesen Erkrankungen zu Grunde liegen, in der Zellkultur zu analysieren. In der vorliegenden Arbeit wurden aus Patientenzellen gewonnene iPSCs verwendet, um die neurogenerative Alzheimer Demenz (AD) sowie die neuronale Entwicklungsstörung Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) in vitro zu modellieren. In Kapitel 2 wird die Generierung von iPSCs aus Zellen eines Patienten mit spät ausbrechender Alzheimer Demenz (LOAD) beschrieben. Diese Zellen, die die seltene triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) R47H Variante tragen, wurden anschließend als Modell für AD verwendet. Hier konnten wir erstmals die in vitro generierten neuronalen Kulturen mit einem Ameloid β (Aβ)-S8C Dimer stimulieren. Durch diesen neuartigen Ansatz, in Kombination mit Transkriptomanalysen, ist es uns gelungen frühe Ereignisse, wie metabolische Disregulation, reduzierte Phagozytose, veränderte Entzündungsantworten und endoplasmischen Retikulum (ER)-Stress, zu identifizieren, die in Neuronen mit der TREM2 R47H Variante zu LOAD führen. In einer weiteren Studie konnten wir zeigen, dass die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) und die Aβ-Produktion durch den Protein Komplex-2 (AP-2 ) kontrolliert werden, der für die APP Endozytose verantwortlich ist. Wir konnten reduzierte AP-2 Level in der neuronalen AD Kultur nachweisen. Dies legt nahe, dass Zellen mit der TREM2 R47H Variante die Transkription von AP-2 auch im Gehirn der AD Patienten herabregulieren. Diese neuen Einblicke in die Mechanismen der frühen Pathologie von AD ermöglichen in der Zukunft die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen. In Kapitel 3 ist beschrieben, wie iPSCs verwendet werden können, um die seltene autosomal rezessive Erkrankung NBS zu studieren. Diese wird durch Mutationen im Nibrin Gen (NBN), das für ein Protein der DNS-Schadensreparatur codiert, ausgelöst. Wir haben erstmals durch Verwendung einer nicht-integrativen Methode eine NBS-iPSC Linie mit der NBN 647del5 Mutation erzeugt. Diese Zellen wurden zu 3D zerebralen Organoiden differenziert, um die molekularen Mechanismen, die einem der prominentesten NBS-Phänotypen, der Mikrozephalie, zu Grunde liegen, zu analysieren. Wir konnten zeigen, dass NBS-Organoide mit der homozygoten 647del5 NBN Mutation signifikant kleiner sind als wildtyp Organoide und dass zusätzlich auch ihre Zellarchitektur gestört ist. NBS-Organoide differenzieren vorzeitig in die neuronale Richtung. Gleichzeitig weisen sie eine erhöhte Neuronatin Expression auf und ihre DNS-Schadensantwort sowie ihr Zellzyklus weichen von dem der Kontrollzellen ab. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass das genotoxische Agens Bleomycin in NBS-Organoiden zu einer verzögerten Aktivierung der p53-vermittelten DNS-Schadensantwort, sowie zu aberranten trans-synaptischen Signalen führt. Dies resultiert schlussendlich in vermehrter Apoptose der Neurone. Unsere Daten geben Einblick in die NBN-vermittelten Veränderungen in der Neurogenese bei NBS-Patienten und zeigen auf, wie zerebrale Organoide das Studium von Erkrankungen ermöglichen, denen DNS-Schäden zu Grunde liegen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die neuartigen Möglichkeiten auf, die sich durch die Verwendung von aus Patienten generierten iPSCs für das Studium neurologischer Erkrankungen ergeben. Insbesondere haben wir gezeigt, dass iPSCs von AD und NBS Patienten als eine Plattform dienen können, um die krankheitsassoziierten Phänotypen zu studieren. Dies öffnet neue Möglichkeiten im Bereich der Krankheitsmodellierung und für die Medikamentenentwicklung.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	11.06.2021
Dateien geändert am:	11.06.2021
Promotionsantrag am:	18.05.2020
Datum der Promotion:	10.03.2021