Dokument: Der Einfluss der FeS-Zentrum-Koordination in Glutaredoxinen auf Physiologie und Pathologie

Titel:	Der Einfluss der FeS-Zentrum-Koordination in Glutaredoxinen auf Physiologie und Pathologie
Weiterer Titel:	The role of FeS cluster coordination in glutaredoxins on physiology and pathology
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56294
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210526-111311-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Engelke, Anna Dorothee [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,86 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.05.2021 / geändert 17.05.2021
Beitragende:	PD Dr. Berndt, Carsten [Gutachter] Prof. Dr. Reichert, Andreas [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Glutaredoxine (Grx) sind lebenswichtige Proteine. Die Proteinfamilie der Grx wird anhand ihres aktiven Zentrums in zwei Untergruppen, die dithiol-Grx (Grx1, Grx2) und monothiol-Grx (Grx3, Grx5), aufgeteilt. Dithiol- und monothiol-Grx weisen zwar nahezu identische Proteinstrukturen auf, haben aber unterschiedliche Funktionen. Dithiol-Grx sind als Oxidoreduktasen wichtig für die Signalübertragung, während monothiol-Grx redox-inaktiv sind und Funktionen in der Eisenhomöostase einnehmen. Außerdem binden monothiol-Grx und wenige dithiol-Grx ein FeS-Zentrum, welches über zwei Cysteine der aktiven Zentren und zwei nicht-kovalent gebundenen Glutathionmolekülen im Homodimer koordinativ gebunden ist. Während die kritischen Aminosäuren im aktiven Zentrum zur FeS-Zentrumsbindung, sowie die Bindungsmotive des FeS-Liganden Glutathion bekannt sind, ist der Einfluss der FeS-Zentrum-Koordination auf die unterschiedlichen Funktionen nicht aufgeklärt. Die Ziele dieser Arbeit sind zum einen die Charakterisierung des Einflusses der Proteinstruktur auf die FeS-Zentrum-Koordination in FeS-Grx, sowie dessen Bedeutung auf die unterschiedlichen Funktionen von monothiol- und dihiol-Grx. Zum anderen sollen neue Funktionen der FeS-Grx in redox- und eisenabhängigen Prozessen, wie bspw. der Oligodendrozytendifferenzierung, identifiziert werden. Die Untersuchungen zeigten, dass ein um fünf Aminosäuren vergrößerter Loop in den monothiol-Grx die FeS-Zentrum-Koordination über veränderte Wechselwirkungen beeinflusst. Als Folge daraus konnte eine verminderte FeS-Stabilität in monothiol-Grx5 festgestellt werden. Mithilfe von Protein Engineering konnte das dithiol-Grx2 durch Austausch des Loops in eine FeS-Transferase und das monothiol-Grx5 durch den Loop-Austausch mit zusätzlichem Austausch des aktiven Zentrums in eine Oxidoreduktase umgewandelt werden. Gleichzeitig führte der Austausch der Loop-Struktur zu einem Verlust oder einer Aktivitätsminderung der ursprünglichen Funktion. Des Weiteren konnten wir einen verminderten protektiven Effekt von Grx2 mit monothiol-Loop in der NO-Entgiftung beobachten. Es konnte jedoch kein Einfluss der FeS-Koordination auf den Reaktionsverlauf der NO-Entgiftung oder auf die Reaktionsprodukte identifiziert werden. In dieser Arbeit konnten außerdem Hinweise auf neue Funktionen in Abhängigkeit des Loops der FeS-Grx gesammelt werden. Zum einen konnte eine Depersulfidierungsaktivität für Grx2 in vitro und in cellulo identifiziert werden, was auf eine regulatorische Funktion von Grx2 an persulfidierten Thiolschaltern schließen lässt. Grx2 und ein Ferroptoseinhibitor zeigten einen protektiven Effekt auf Myelinstrukturen, wobei eine Ferroptoseinduktion nur sehr geringe Effekte darauf hatte. Außerdem konnte in dieser Arbeit eine beschleunigte Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen mit herunterregulierten Grx3-Expressionen beobachtet werden. Verminderte Grx5-Level äußerten sich in einer beeinträchtigten Differenzierung. In vivo hatten verminderte monothiol Grx-Level keinen Effekt auf die Myelinisierung. Verminderte Expressionen der monothiol-Grx hatten keinen Einfluss auf die Molybdän-Kofaktor-Biosynthese. Zusammenfassend beeinflusst ein vergrößerter Loop aus fünf Aminosäuren die FeS-Koordination in monothiol- und dithiol-Grx und stellt eine molekulare Erklärung für die unterschiedlichen Funktionen der monothiol- und dithiol-Grx dar. Außerdem konnte Grx2 als potenzieller Regulator von Thiol-Persulfidierungen identifiziert werden. Die vorliegenden Daten schlagen Grx3 als potenziellen Ansatzpunkt für eine beschleunigte Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen vor, was eine schnellere Remyelinisierung bei demyelinisierenden Erkrankungen begünstigen könnte. Glutaredoxines (Grx) are essential proteins. The protein family of Grx is subdivided by their active site composition into two major subfamilies, the dithiol Grx (Grx1, Grx2) and the monothiol Grx (Grx3, Grx5). Dithiol and monothiol Grx have a very close structural similarity, however, their functions are different. Whereas dithiol Grx are oxidoreductases and important for signaling, monothiol Grx are redox inactive and functioning in iron homeostasis. Additionally, monothiol Grx and a few dithiol Grx coordinate a FeS cluster, which is bound by two active-site cysteines and two non-covalently bound glutathione molecules in a homo dimer. Although the critical amino acids in the active site for FeS cluster binding and the glutathione binding motifs are known, the impact of the FeS cluster coordination and its structural environment on the different functions are unresolved. The aims of this study were firstly, to characterize the impact of the protein structure on the FeS cluster coordination in FeS-Grx, as well as its implications on the different functions of monothiol and dithiol Grx and secondly, to identify new functions of the FeS-Grx in redox- or iron-dependent processes, like the differentiation of oligodendrocytes. The findings demonstrate that an insertion of five amino acids enlarging a loop in monothiol Grx affects FeS cluster coordination. Consequently, a decreased FeS cluster stability was measured. Protein engineering of dithiol Grx2 with an exchange of the loop leads to a gain of function as FeS-transferase. Monothiol Grx5 with loop exchange and additional active site exchange switched its functions to an oxidoreductase. At the same time the proteins lost their original functions completely or in part when the loop was exchanged. In addition, we showed that Grx2 with the monothiol loop decreased the protective function of Grx2 in NO-detoxification. However, we were not able to show an impact of FeS coordination on the reaction of NO-detoxification or on potential products of this reaction. This thesis revealed further evidence of new functions of the FeS-Grx. Firstly, a de-persulfidation activity of Grx2 was shown in vitro and in cellulo, which suggests a regulatory function of Grx2 on persulfidated thiol switches. Grx2 and an inhibitor of ferroptosis revealed protective effects on myelin structure, whereas a ferroptosis inductor showed only minor effects. Furthermore, it has been shown, that decreased Grx3 levels in oligodendrocyte progenitor cells accelerated the differentiation. Decreased Grx5 levels lead to an impaired differentiation. In vivo experiments with reduced monothiol Grx level in zebrafish resulted in an unaffected myelination. Diminished expression of monothiol Grx revealed no effect on molybdenum cofactor biosynthesis. In conclusion, an enlarged loop by five additional amino acids affects the FeS-cluster coordination in monothiol and dithiol Grx and provides a molecular explanation for the different functions of monothiol and dithiol Grx. Furthermore, Grx2 was identified as potential regulator of thiol persulfidation. The presented data suggest Grx3 as a potential target for the acceleration of oligodendrocyte progenitor cell differentiation, which could be beneficial for remyelination in demyelinating diseases.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	26.05.2021
Dateien geändert am:	26.05.2021
Promotionsantrag am:	17.12.2020
Datum der Promotion:	22.04.2021