Dokument: Identification and characterization of novel cytochromes P450 from actinomycetes

Titel:	Identification and characterization of novel cytochromes P450 from actinomycetes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56271
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210615-110003-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hilberath, Thomas [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,51 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.05.2021 / geändert 14.05.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Cytochromes P450 (CYP or P450) are heme-b containing oxidoreductases that catalyze the reductive cleavage of molecular oxygen and oxidation of non-activated and activated C-H bonds of a vast variety of organic molecules. One oxygen atom is introduced into the substrate while the second one is reduced to water. The electrons required for catalysis are mainly transferred from NAD(P)H via redox partner proteins to the heme iron of the P450. P450s play an important role in the metabolism of xenobiotics and drugs as well as in the biosynthesis of secondary metabolites. Consequently, these enzymes are of biotechnological relevance as biocatalysts for the production of drug metabolites and other pharmaceutically relevant active ingredients. In this context, bacterial P450s from actinomycetes are of particular interest as they are either directly involved in the biosynthesis of pharmaceutically active compounds or can be used for the production of human drug metabolites. In this thesis new P450s from actinomycetes were identified and characterized. Specifically, P450s from Streptomyces platensis and Pseudonorcardia autotrophica were investigated, as these bacteria are used by pharmaceutical companies for the production of drug metabolites. Based on the sequenced genomes, 70 putative P450 genes were identified in both strains. Sixteen of these P450 genes were heterologously expressed in Escherichia coli and subsequently tested for their activity against a set of drug compounds. A two-step screening was developed to identify promising enzyme candidates with a broad substrate spectrum and diversified product selectivity. By testing with the three structurally different model drugs ritonavir, testosterone, and amitriptyline, CYP105D and CYP107Z from S. platensis were identified as the most promising P450s in the first step. In the second step, structurally related molecules and derivatives of the model drugs were tested as substrates for CYP105D and CYP107Z. Thus, a correlation between the chemo- and regioselectivity of the P450 enzymes and the chemical structure of the target drugs could be shown. In the next step, the cytochrome P450 complement (CYPome) of S. platensis was investigated. The CYPome of S platensis consists of 39 P450 genes, which were differentiated with respect to their phylogenetic families, possible functions in the secondary metabolism and heterologous expression in E. coli. Comparative activity studies with chemically diverse drug substrates revealed a panel of cytochromes P450 from S. platensis with high potential for the production of drug metabolites. In a further study, CYP105D from S. platensis was identified as a promising biocatalyst to oxidize bile acids. Bile acids such as chenodesoxycholic acid are converted with lower activity and selectivity compared to other steroid substrates like testosterone. The type and position of polar groups in the molecule seem to have a decisive influence as it was shown by testing bile acids with different functional groups. Oxidation of chenodeoxycholic acid has not been reported for any other bacterial P450 before. NMR analysis of the products provided information on the structure of new bile acid metabolites with a modified side chain. Finally, the applicability of recombinant lyophilized E. coli cells expressing P450 enzymes and redox partners for biocatalysis was demonstrated. For this purpose, a whole-cell catalyst was constructed which allows the oxidation of testosterone by CYP105D. Subsequently, the regeneration of the cofactor NADH by a co-expressed alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis (Re-ADH) was analyzed. The cofactor regeneration by ADH was found crucial for activity of lyophilized cells. The possibility to use P450s in lyophilized whole cell catalysts opens up new possibilities for a broader application of these enzymes for biocatalysis. Cytochrome P450 (CYP oder P450) sind Häm-b-haltige Oxidoreduktasen, die die reduktive Spaltung von molekularem Sauerstoff und die Oxidation von nicht aktivierten und aktivierten C-H Bindungen von einer Vielzahl organischer Moleküle katalysieren. Dabei wird ein Sauerstoffatom in das Substrat eingeführt, während das zweite zu Wasser reduziert wird. Die zur Katalyse benötigten Elektronen werden zumeist von NAD(P)H über Redoxpartnerproteine auf das Häm-Eisen der P450 übertragen. P450 spielen eine bedeutende Rolle bei der Verstoffwechselung von Xenobiotika und Arzneistoffen sowie in der Biosynthese von Sekundärmetaboliten. Folglich sind diese Enzyme als Biokatalysatoren von biotechnologischer Relevanz für die Herstellung von Arzneistoffmetaboliten und anderen pharmazeutisch relevanten Wirkstoffen. In diesem Zusammenhang sind bakterielle P450 aus Actinomyceten besonders interessant, da diese entweder direkt an der Biosynthese pharmazeutischer Wirkstoffe beteiligt sind oder für die Herstellung von humanen Arzneistoffmetaboliten eingesetzt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue P450 aus Actinomyceten identifiziert und charakterisiert. Konkret wurden P450 aus Streptomyces platensis und Pseudonorcardia autotrophica untersucht, da diese Bakterien von pharmazeutischen Unternehmen zur Herstellung von Arzneistoffmetaboliten genutzt werden. Ausgehend von den sequenzierten Genomen wurden 70 putative P450 Gene in beiden Stämmen identifiziert. Sechzehn dieser P450 Gene wurden heterolog in Escherichia coli exprimiert und anschließend hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber einer Reihe von Arzneistoffen getestet. Um besonders vielversprechende Enzymkandidaten mit einem breiten Substratspektrum und unterschiedlicher Produktselektivität zu identifizieren, wurde ein zweischrittiges Screeningverfahren entwickelt. Durch Testung mit den drei strukturell verschiedenen Modellarzneistoffen Ritonavir, Testosteron und Amitriptylin wurden CYP105D und CYP107Z aus S. platensis im ersten Schritt als vielversprechendste P450 identifiziert. Im zweiten Schritt wurden strukturell ähnliche Moleküle und Derivate der Modelarzneistoffe als Substrate für CYP105D und CYP107Z getestet. Dadurch konnte ein Zusammenhang zwischen der Chemo-und Regioselektivität der P450 Enzyme und chemischer Struktur der Arzneistoffe gezeigt werden. Im nächsten Schritt wurde das Cytochrom P450 Komplement (CYPome) von S. platensis weiter untersucht. Das CYPome besteht aus insgesamt 39 P450 Genen, die hinsichtlich ihrer phylogenetischen Familien, möglichen Funktionen im Sekundärstoffwechsel und heterologer Expression in E. coli differenziert wurden. Vergleichende Aktivitätsstudien mit chemisch unterschiedlichen Arzneistoffsubstraten zeigten, dass verschiedene Cytochrome P450 aus S. platensis ein hohes Potential zur Produktion von Arzneistoffmetaboliten besitzen. In einer weiteren Studie wurde CYP105D aus S. platensis als vielversprechender Biokatalysator zur Oxidation von Gallensäuren identifiziert. Gallensäuren, wie Chenodesoxycholsäure, wurden im Vergleich zu anderen Steroidsubstraten, wie Testosteron, mit geringerer Aktivität und Selektivität umgesetzt. Einen entscheidenden Einfluss scheinen dabei die Art und die Position polarer Gruppen im Molekül zu haben, wie durch Testung von Gallensäuren mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen gezeigt wurde. Die Oxidation von Chenodeoxycholsäure wurde bisher für keine andere bakterielle P450 nachgewiesen. Die NMR-Analyse der Produkte lieferte Hinweise auf die Struktur neuer Metaboliten von Gallensäuren, die an der Seitenkette modifiziert wurden. Abschließend wurde die Anwendbarkeit von rekombinanten lyophilisierten E. coli-Zellen, die P450-Enzyme und Redoxpartner exprimieren, für die Biokatalyse demonstriert. Hierzu wurde zunächst ein Ganzzellkatalysator zur Oxidation von Testosteron durch CYP105D konstruiert. Anschließend wurde die Regenerierung des Kofaktors NADH durch eine koexprimierte Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis (Re ADH) analysiert. Es wurde festgestellt, dass die Kofaktorregeneration durch ADH entscheidend für die Aktivität lyophilisierter Zellen ist. Die Möglichkeit, P450 in lyophilisierten Ganzzellkatalysatoren einzusetzen, eröffnet neue Möglichkeiten für eine breitere Anwendung dieser Enzyme für die Biokatalyse.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	15.06.2021
Dateien geändert am:	15.06.2021
Promotionsantrag am:	13.08.2020
Datum der Promotion:	27.10.2020