Dokument: Physiologische und biochemische Charakterisierung einer neuen Phospholipase B aus Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Physiologische und biochemische Charakterisierung einer neuen Phospholipase B aus Pseudomonas aeruginosa
Weiterer Titel:	Physiological and biochemical characterization of a novel phospholipase B from Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56228
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210510-110136-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Weiler, Andrea Jeanette [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 11,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.05.2021 / geändert 10.05.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Univ. Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	Pseudomonas aeruginosa, Phospholipase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	P. aeruginosa steht wegen seiner humanpathogenen Eigenschaften und der Fähigkeit, leicht Resistenzen gegen zahlreiche Antibiotika zu entwickeln, im Fokus der Wissenschaft. Die Pathogenität des Bakteriums beruht hauptsächlich auf der Produktion einer Vielzahl von Virulenzfaktoren und seiner hohen physiologischen Anpassungsfähigkeit. Phospholipasen im Allgemeinen sind an der Kontrolle der Membranzusammensetzung und -Synthese beteiligt. Sekundäre Botenstoffe, die durch die Hydrolyse von Phospholipiden freigesetzt werden, sind an Entzündungsreaktionen beteiligt. Dementsprechend könnte eine Hemmung der Phospholipase-Aktivität helfen, bakterielle Infektionen einzudämmen. Trotz der bekannten wichtigen Rolle solcher Enzyme bei Infektionen sind viele putative Phospholipasen von P. aeruginosa noch völlig unbekannt bzw. nicht charakterisiert. Das Ziel dieser Arbeit war die detaillierte biochemische und physiologische Charakterisierung von PA2927, einer putativen Phospholipase, anhand von Sequenzhomologie-Studien. Es wurde bestätigt, dass das Gen pa2927 für die Phospholipase PaPlaB, ein Mitglied der Serinhydrolase-Familie, kodiert. Um ausreichende Mengen an aktivem Protein für die biochemische Charakterisierung zu erhalten, wurde erstmals die heterologe Expression in E. coli C43(DE3) eingesetzt und damit die komplexen regulatorischen Prozesse in P. aeruginosa selbst umgangen. Biochemische Analysen des gereinigten Proteins zeigten, dass PaPlaB bis zu 42 °C stabil und enzymatisch aktiv ist. So gelang es, PaPlaB der Klasse der Phospholipasen B zuzuordnen und eine membranassoziierte Lokalisation des Proteins aufzudecken. Mittels Größenausschlusschromatographie und MALS wurde gezeigt, dass PaPlaB in mehreren Aggregationsformen vorliegt. Die Konstruktion eines PaPlaB-defizienten P. aeruginosa Stammes ermöglichte eine detaillierte Untersuchung der physiologischen Rolle von PaPlaB. Obwohl P. aeruginosa zahlreiche (putative) Phospholipase-kodierende Gene besitzt, wurde die Phospholipaseaktivität durch die alleinige Deletion von paplaB um 35 % reduziert. Die Deletionsmutante zeigte phänotypisch (I) ein verlangsamtes Wachstum während der logarithmischen Wachstumsphase, (II) eine verringerte Biofilmbildung und (III) eine um 50 % reduzierte Pyoverdinproduktion. Die Menge vieler Pvd Proteine waren reduziert, aber PvdL zeigte sich in besonderem Maße beeinflusst. Globale Proteomstudien zeigten weitere bemerkenswerte pleiotrope Effekte der paplaB-Deletion auf P. aeruginosa Stoffwechselwege wie der Leucin-Biosynthese oder β-Oxidation. Darüber hinaus erwies sich der P. aeruginosa ΔplaB-Stamm im G. mellonella-Virulenzmodell als weniger virulent als der Wildtyp. Zusammenfassend zeigte diese Studie zum ersten Mal die bedeutende Funktion der Phospholipase B PaPlaB, innerhalb der regulatorischen Netzwerke von P. aeruginosa und stellt somit einen wichtigen Schritt zum Verständnis des Phospholipase-Netzwerks für die Physiologie dieses wichtigen Humanpathogens dar. Der hier gezeigte Beitrag zur Virulenz und Biofilmbildung legt nahe, dass dieses Enzym ein vielversprechendes Ziel für zukünftige Anti-Virulenz-Medikamente zur Bekämpfung von Infektionen mit antibiotikaresistenten P. aeruginosa ist. P. aeruginosa is in the focus of science because of its human pathogenic properties and the ability to easily develop resistance to numerous antibiotics. The bacterium's pathogenicity relies mainly on the production a variety of virulence factors and its high physiological adaptability. Phospholipases in general are involved in the control of membrane composition and synthesis. Secondary messengers released by the hydrolysis of phospholipids are involved in inflammatory responses. Accordingly, inhibition of phospholipase activity could help to fight bacterial infections. Despite the known major role of such enzymes in infections, many putative phospholipases of P. aeruginosa are still completely uncharacterized. The aim of this work was the detailed biochemical and physiological characterization of PA2927, a putative phospholipase according to sequence homology studies. It was confirmed that the pa2927 gene encodes the phospholipase PaPlaB, a member of the serine hydrolase family. To obtain sufficient amounts of active protein for biochemical characterization, heterologous expression in E. coli C43(DE3) was used for the first time, thus avoiding the complex regulatory processes in P. aeruginosa itself. Biochemical analyses of the purified protein showed that PaPlaB is stable up to 42 °C and enzymatically active. This way, it succeeded to assign to the phospholipases B class and to reveal a membrane-associated localization of the protein. Using size exclusion chromatography and MALS, PaPlaB was shown to exist in multiple aggregation forms. The construction of a paplaB-deficient P. aeruginosa strain allowed for a detailed investigation of the physiological role of PaPlaB. Although P. aeruginosa possesses numerous (putative) phospholipase encoding genes, phospholipase activity was reduced by 35% by the sole deletion of paplaB. The deletion mutant phenotypically exhibited (I) slowed growth during the logarithmic growth phase, (II) reduced biofilm formation, and (III) 50% reduced pyoverdine production. The levels of many Pvd proteins were reduced but PvdL levels showed to be particularly affected. Global proteomic analyses revealed further remarkable pleiotropic effects of paplaB deletion on P. aeruginosa metabolic pathways like leucine-biosynthesis or β-oxidation. In addition, the P. aeruginosa ΔplaB strain was proven to be less virulent than the wild type in the G. mellonella virulence model. Conclusively, this study showed for the first time the significant function of the phospholipase B PaPlaB, within the regulatory networks of P. aeruginosa and constitutes thus an important step towards the understanding of the phospholipase network on the physiology of this important human pathogen. Its contribution to virulence and biofilm formation revealed herein suggests this enzyme to be promising target for future anti-virulence drugs to tackle infections of antibiotic-resistant P. aeruginosa.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	10.05.2021
Dateien geändert am:	10.05.2021
Promotionsantrag am:	22.12.2020
Datum der Promotion:	22.04.2021