Dokument: Bioanalytical evaluation of the neuropeptide Substance P in human plasma using a chemometrically developed and validated mass spectrometric assay

Titel:	Bioanalytical evaluation of the neuropeptide Substance P in human plasma using a chemometrically developed and validated mass spectrometric assay
Weiterer Titel:	Bioanalytische Evaluation des Neuropeptids Substanz P in Blutplasma mittels einer chemometrisch entwickelten und validierten massenspektrometrischen Methode
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56150
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210505-111615-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl.-Pharm. Feickert, Martin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 29,86 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 29.04.2021 / geändert 29.04.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Läer, Stephanie [Gutachter] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Das Neuropeptid Substanz P steht seit kurzem als kardialer Entzündungsmediator im Fokus der Wissenschaft. Da die exzessive Freisetzung von Substanz P in Tiermodellen mit der Entwicklung von Kardiomyopathien und Herzinsuffizienz assoziiert ist, wäre Substanz P ein vielversprechender Biomarker. Die erhobenen humanen Substanz P-Plasmaspiegel wurden jedoch bisher ausschließlich mit Immunassays bestimmt, obwohl die Tests Kreuz-Reaktivität zu humanem Hemokinin-1 zeigten. Folglich ist der Einsatz der Massenspektrometrie eine bioanalytische gleichwohl zurzeit fehlende Alternative, um Substanz P selektiv im Blutplasma zu bestimmen. Da die Quantifizierung endogener Peptide mittels Massenspektrometrie wegen der niedrigen Konzentrationen im picomolaren Bereich eine besondere Herausforderung darstellt, war eine umfassende Methodenentwicklung gefordert, um eine sensitive massenspektrometrische Methode mit vergleichbaren Detektionslimits zu geläufigen Immunassays zu etablieren. Durch die Anwendung eines dafür eigens entwickelten statistischen Versuchskonzepts wurden systematisch kritische Methodenaspekte wie die unspezifische Peptidadsorption, die Plasmaextraktion und die chromatographische Trennung der Analyten gezielt adressiert und optimiert. Die entwickelte Methode wurde darauf erfolgreich nach internationalen bioanalytischen Richtlinien validiert und erlaubt einen breiten Quantifizierungsbereich, der die bisher erhobenen Plasmaspiegel durch Immunassays abdeckt. Bei dem Einsatz der validierten Methode wurden jedoch unerwartet keine endogenen Level an Substanz P und humanem Hemokinin-1 in Plasmaproben detektiert, obwohl die Methode ihre Anwendbarkeit in anderen humanen Körperflüssigkeiten erfolgreich demonstrierte. Bei der Nutzung derselben Plasmaproben konnte immuno-reaktive Substanz P mittels eines kommerziellen Immunoassays quantifiziert werden. Mit Hilfe hochauflösender Massen-spektrometrie wurde daraufhin an Stelle von biologisch aktiver Substanz P die biologisch inaktive freie Säure von Substanz P zum ersten Mal in Plasma identifiziert. Da die freie Säure jedoch keine Kreuz-Reaktivität zeigte, wurde zur Identifizierung von immuno-reaktiver Substanz P ein hybrides immuno-reaktives-massenspektrometrisches Verfahren entwickelt. Die darauffolgende Identifizierung der immuno-reaktiven Substanz zeigte die Anwesenheit eines Vorläufermoleküls von Substanz P als möglichen kross-reaktiven Analyten in humanem Blutplasma. Basierend auf diesen Ergebnissen ist eine Neubeurteilung der bisher von Immunassays gemessenen Substanz P-Level notwendig. Das im Plasma gefundene Propeptid von Substanz P bedarf künftiger Studien, um seine biologische Rolle und seinen möglichen Nutzen als klinischer Biomarker in entzündlichen Erkrankungen zu evaluieren. The neuropeptide Substance P has recently received much attention as a mediator of cardiac inflammation. Since Substance P is strongly associated with the development of cardiomyopathies and heart failure in animal models, its use as a biomarker is highly promising. The limited data on Substance P levels in subjects with cardiovascular diseases demonstrate highly variable plasma concentrations and, therefore, complicates its use as a potential biomarker. Human Substance P levels have only been examined by immunoassays, although they are no longer recommended owing to their limited ability to differentiate accurately between Substance P and its relative human Hemokinin-1. The application of mass spectrometry (MS) is promising, but this bioanalytical alternative is lacking for accurate quantification of Substance P. As endogenous peptide quantification by MS is especially challenging due to the presence of Substance P in low picomolar concentrations, a comprehensive method development is required to acquire a highly sensitive MS assay with limits of detection comparable to those of existing immunoassays. By applying a newly developed multi-step Design of Experiments concept encompassing all sample preparation and assay steps, critical aspects of methodology, such as nonspecific peptide adsorption, plasma protein extraction, and chromatographic separation, were identified and optimized for reliable and sensitive quantification of Substance P and human Hemokinin-1 in human plasma. Lean development methodology was followed by successful validation according to US Food and Drug Administration bioanalytical regulatory guidelines; this resulted in a wide quantification range suitable for endogenous quantification of the neuropeptides. The implementation of the developed hyphenated technique unexpectedly revealed no detectable Substance P and human Hemokinin-1 levels in human plasma, although the assay proved its applicability in other biological fluids. Using the same plasma samples, immunoreactive Substance P plasma levels were successfully quantified by a commercially available immunoassay. Instead of biologically active Substance P, the biologically inactive carboxylic acid of Substance P was identified in human plasma by MS analysis and primarily described. As the carboxylic acid of Substance P did not show cross-reactivity in the applied immunoassay, a hybrid immunocapture MS approach was developed to identify immunoreactive Substance P. The subsequent compound discovery of the immunocaptured substance indicated the presence of a precursor of Substance P as a cross-reactor in human plasma samples. Based on these findings, the concentrations of Substance P and its function as a biomarker of cardiac inflammation described in previous studies have to be reevaluated due to the cross-reactivity issues of the immunoassays used. Accordingly, future studies have to assess the biological role of the observed propeptide of Substance P in human plasma and its potential as a clinical biomarker of inflammatory diseases.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Klinische Pharmazie und Pharmakotherapie
Dokument erstellt am:	05.05.2021
Dateien geändert am:	05.05.2021
Promotionsantrag am:	01.12.2020
Datum der Promotion:	22.04.2021