Dokument: The development and validation of a bioanalytical hybrid approach to determine active renin and its precursor utilizing high-resolution mass spectrometry
| Titel: | The development and validation of a bioanalytical hybrid approach to determine active renin and its precursor utilizing high-resolution mass spectrometry | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56148 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210503-113140-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Burdman, Ilja [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Läer, Stephanie [Gutachter] Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Das Renin-Angiotensin-Aldosteron System ist von zentraler physiologischer Bedeutung, wobei die Aspartyl-Protease Renin als Geschwindigkeit bestimmender Schritt bei der Aktivierung der Kaskade angesehen wird. Da das Wissen zu Renin und seiner Vorstufe Prorenin bei Kindern limitiert ist, wurde einführend zu dieser Arbeit eine systematische Literaturrecherche entsprechend der PRISMA Methode durchgeführt. Aus den 15 identifizierten und eingeschlossenen pädiatrischen Studie lies eine altersabhängige Abnahme von Renin und Prorenin schlussfolgern. Der Review zeigte außerdem, dass bisher verbreitet eingesetzte Immunoassays sich dadurch charakterisieren, dass sie anfällig für Variationen bei der Durchführung sind. Vor allem aber diskriminieren sie nicht ausreichend zwischen Renin und Prorenin, sodass es durch die vom Hersteller angegebenen Kreuz-Reaktivität von bis zu 50% falsche Renin Werte gemessen werden können. Obwohl die Flüssigchromatographie gekoppelt an einen Massenspektrometer (LC-MS) hier eine vielversprechende Alternative darstellt, sind in der Literatur bisher keine Quantifizierungsansätze zur Bestimmung von Renin und Prorenin beschrieben. Deshalb wurde ein neuer Hybrid-Assay unter Verwendung der Massenspektrometrie mit einer vorgeschalteten Immunoaufreinigung für humanes Renin entwickelt und etabliert. Der hierbei genutzte experimentelle Ansatz des Design of Experiments (DOE), der im Gegensatz zum ‚ein Faktor nach dem anderen Faktor‘-Ansatz (engl.: OFAT) in der Bioanalytik noch nicht weit verbreitet ist, erlaubte neben der Reduktion der Versuche vor allem eine systematische Austestung und Kombination der Parameter bei der Proteinquantifizierung. Hierauf aufbauend wurde im Nachgang ebenfalls mit Unterstützung des DOE Ansatzes eine eigenständige Methode für Prorenin entwickelt, die sich durch ein beschleunigtes Verdauverfahren mittels eines organisch-wässrigem Mediums auszeichnete und verglichen mit den konventionell tryptischen ‚Übernacht Verdau‘ die Analytik dieser Proteine innerhalb eines Labortages ermöglichte. Obwohl durch diesen LC-MS Ansatz nun beide Substanzen verlässlich voneinander unterschieden und bestimmt werden können, bedurfte es einer nachgeschalteten Assayoptimierung, bei der besonders nicht-spezifische Bindung an Verbrauchsmaterialien als Faktor für unzureichende Sensitivität für die Erfassung endogener Konzentrationen ausgemacht werden konnte. Die erfolgreiche Adressierung dieser Punkte haben maßgeblich zur verbesserten Empfindlichkeit des Assays beigetragen. Nach einer erfolgreichen Verifikation der optimierten, schlanken und schnelldurchführbaren Hybridmethode steht nun ein Quantifizierungsansatz zur Verfügung, der nun maßgeblich dazu beitragen krankheitensbedingte Veränderungen der Konzentrationen von Prorenin und aktivem Renin in adulten als auch in vulnerablen Populationsgruppen besser zu erfassen.The renin-angiotensin-aldosterone system is of central physiological importance because the aspartyl protease renin is thought to be the rate-determining step of a signaling cascade. Knowledge regarding renin and its precursor prorenin in children is limited; therefore, a systematic literature search, performed according to the PRISMA method, represents the introduction to this work. From 15 identified pediatric studies included in this systematic analysis, an age-related decrease in renin and prorenin levels was identified.
The review also showed that commonly used immunoassays are characterized by high degrees of performance variations. Most importantly, they do not discriminate sufficiently between renin and prorenin, so that up to 50% of the active renin might be detected falsely. Although this value appears to be low, when prorenin concentrations are high, this cross-reactivity can significantly distort the true active renin values. Although liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) is a promising alternative to immunoassays, no LC-MS approaches for the determination of renin and prorenin have been described in the literature thus far. Therefore, a new hybrid assay using high-resolution MS, combined with the upstream immuno-purification of human renin, has been developed and established in this thesis. The design of experiments (DOE) approach, which was not widely applied in the field of bioanalytical research compared to the ‘one-factor at a time’ approach (OFAT), was applied to reduce the necessary number of experiments, and a systematic testing approach was used to optimize the combination of parameters to achieve high sensitivity protein quantification. Based on the DOE approach, an independent method for prorenin identification was subsequently developed, which is characterized by an accelerated digestion process using an organic-aqueous medium. Compared to the conventionally used ‘over-night’ digestion, the duration of the protein’s analysis was reduced to a routine laboratory day. Although this MS-based approach allows for the reliable differentiation and determination of both substances, downstream assay optimization was necessary to reduce non-specific binding to consumables and the injection medium, which were determined to represent factors influencing the insufficient sensitivity for endogenous protein detection. By addressing these issues and performing statistical analyses of the injection solvent composition, assay sensitivity was significantly improved. The successful verification of the optimized, lean, and fast hybrid method has resulted in the availability of an MS-based quantification approach for the reliable differentiation and detection of endogenous renin and prorenin levels and which can significantly contribute to the detection of renin-associated diseases in adults and vulnerable populations. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Bezug: | 01.01.2017-31.12.2020 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Klinische Pharmazie und Pharmakotherapie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.05.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.05.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.12.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.04.2021 |
