Dokument: Molecular tools for genome engineering of Corynebacterium glutamicum
| Titel: | Molecular tools for genome engineering of Corynebacterium glutamicum | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56070 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210428-101641-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Sonntag, Christiane [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Zurbriggen, Matias [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Angesichts der Forderungen nach umweltfreundlichen und nachhaltigen Produktionsverfahren werden Mikroorganismen für die biotechnologische Produktion von Chemikalien, Kraftstoffen oder Lebensmittel- und Futtermittelzusätzen aus erneuerbaren Ressourcen entwickelt. Die Stammentwicklung ist jedoch mühsam, zeitaufwendig und teuer. Daher ist die Entwicklung und Verbesserung von molekularen Werkzeugen für die Gentechnik und Methoden zur Hochdurchsatz-Charakterisierung in der Stammentwicklung von großer Bedeutung.
Aus diesem Grund wurde das CRISPR/ Cas12a-Rekombinations-System in Corynebacterium glutamicum, durch die Entwicklung des leicht zu modifizierenden crRNA-delivery Vektors pJYScr verfeinert. Die Targeting- und Editiereffizienz des CRISPR/ Cas12a-Systems in Kombination mit dem neuen pJYScr Plasmid und einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden wurde systematisch evaluiert, indem genetische Mutationen proximal und distal zu einer ausgewählten PAM-Stelle in ein genomisches lacZ-Gen eingefügt wurden, welches für die β-Galaktosidase kodiert. Durch die Vereinfachung der Anwendung des CRISPR/ Cas12a-Rekombinationssystems wurde dies schließlich eingesetzt, um eine Codon-Sättigungsmutagenese an kritischen Aminosäureresten im mechanosensitiven Kanal MscCG durchzuführen. Die erzeugten Varianten wurden hinsichtlich eines erhöhten L-Glutamat-Effluxes charakterisiert, wodurch neue Mutationsorte in MscCG identifiziert werden konnten, die zu einer verbesserten L-Glutamatsekretion führen. Ebenso wie der Einsatz von zuverlässigen Methoden zur genetischen Manipulation in der Stammentwicklung sind auch geeignete Werkzeuge für die schnelle Identifizierung produzierender Stammvarianten in größeren Mutanten-Bibliotheken bedeutend. In diesem Zusammenhang ermöglichen auf Transkriptionsregulatoren basierende, fluoreszierende Biosensoren die semiquantitative Bestimmung von Metaboliten auf Einzelzellebene. Die Anwendungsmöglichkeiten solcher transkriptionellen Biosensoren sind jedoch oft durch die intrinsischen Eigenschaften des nativen Regulationskreislaufs limitiert. So kann der Einsatz von Biosensoren durch Signalsättigung bei niedrigen Konzentrationen oder einer verringerten oder gar fehlenden Funktionalität in heterologen Organismen stark eingeschränkt sein. Aus diesem Grund wurde ein vereinheitlichtes Biosensordesign entwickelt, das nicht nur die Feinabstimmung wichtiger Sensorparameter erlaubt, sondern auch den Einsatz von Sensoren in heterologen Organismen ermöglicht. Die Sensorantwort wird anhand der Expressionsstärke des jeweiligen Gens für den Transkriptionsregulator durch verschiedene (synthetische) konstitutive Promotoren gesteuert. Anhand dieses neuen Designprinzips wurde ein Set von Biosensoren auf Basis der Transkriptionsregulatoren LysG und PhdR und ihrer jeweiligen Zielpromotoren aus C. glutamicum für den Einsatz im nativen Wirtssystem und in Escherichia coli konstruiert. Die detaillierte Charakterisierung dieser Biosensoren in Flüssigkultur sowie in Durchflusszytometrieexperimenten zeigte, dass das Sensordesign die Modifizierung wichtiger Biosensorparameter erlaubt, und eine Anwendung in verschiedenen Bakterien ermöglicht.Facing the demand for environmental friendly and sustainable production processes, microorganisms are engineered for the industrial biosynthesis of chemicals, fuels, or food and feed additives from renewable resources. However, microbial strain development is still laborious, time-consuming and expensive, which constricts the transition to a more bio-based economy. Therefore, development and consistent improvement of molecular tools for genetic engineering as well as methods for the high-throughput characterization of engineered strain variants are of great importance. For this purpose, the CRISPR/ Cas12a recombineering method for Corynebacterium glutamicum, a well-characterized microorganism employed in the industrial amino acid production, was refined by developing the flexible and easy to assemble crRNA delivery vector pJYScr. Targeting and editing efficiency of this new CRISPR/ Cas12a system was systematically evaluated by inserting genetic mutations proximal and distal to a selected PAM site in a genomic lacZ gene encoding for β-galactosidase. Subsequently, this improved method allowing for accelerated genome editing of C. glutamicum was applied in a strain engineering campaign aiming for improved L-glutamate efflux. For this purpose single-stranded DNA oligonucleotides targeting critical amino acid residues in the mechanosensitive channel MscCG of C. glutamicum were used for CRISPR/ Cas12 recombineering. Several generated strain variants were characterized with regard to their respective L-glutamate efflux identifying new gain-of-function mutations, which improve L-glutamate export in C. glutamicum. To the same extent as fast and reliable genetic engineering, rapid identification of producing strain variants in larger libraries is a crucial step in strain development. In this respect, transcription factor-based, fluorescent biosensors are valuable tools in metabolic engineering allowing for semiquantitative determination of metabolites in single cells. However, transcriptional biosensors are often limited by intrinsic characteristics of the used native regulatory circuit. Moreover, signal saturation at low inducer concentrations typically limits their use in producer strains at advanced engineering stages, and the application of biosensors in heterologous host systems is often not possible. Therefore, a unified biosensor design was established, which allows fine-tuning of important sensor parameters and ensures a sensor response in a heterologous expression host. As a key feature of the design, the regulator activity can be controlled through modulation of the regulator gene expression level by using different (synthetic) constitutive promoters. Several biosensors based on transcriptional regulators LysG and PhdR and their cognate promoters from C. glutamicum were constructed for applications in the native host and in Escherichia coli. Detailed characterization of these biosensors in liquid cultures and on the single-cell level using flow cytometry showed that the sensor design enables customization of important biosensor parameters as well as application of these sensors in two different bacterial species. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.04.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.04.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 03.11.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.11.2020 |
