Dokument: Linking Granzyme H to NK-Cell Education – An Examination of Expression Patterns and Functions.

Titel:	Linking Granzyme H to NK-Cell Education – An Examination of Expression Patterns and Functions.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=56012
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210422-131449-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bongards, Eva Nora [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,99 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.04.2021 / geändert 16.04.2021
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Uhrberg, Markus [Gutachter] Univ.-Prof. Dr. Timm, Jörg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Natürliche Killer (NK)-Zellen erwerben bei der Zell-Lizensierung durch das Binden entsprechender Liganden an selbstspezifische inhibitorische Rezeptoren funktionale Kompetenz. NK-Zellen, die keine solchen Rezeptoren exprimieren, werden hyporesponsiv. Die intrazellulären Mechanismen sowie die Unterschiede zwischen lizensierten und nichtlizensierten Zellen sind weitgehend unbekannt. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Expression von Granzym (gr) B, eines der wichtigsten NK Zell-Effektormole-küle, auf Proteinebene in lizensierten NK Zellen höher ist als in nichtlizensierten. Das humane grH ist grB in Sequenz und Struktur sehr ähnlich, aber weniger erforscht. Daher wurde eine potenzielle Korre-lation zwischen NK Zell-Lizensierung und grH-Expression gesucht und eine Analyse der Expressions-muster und Funktionen von grH durchgeführt. In vorläufigen Experimenten sahen die Arbeitsgruppen von Prof. Dr. M. Uhrberg, Düsseldorf, und Prof. Dr. L. Walter, Göttingen, dass die Expression von GZMH (Genname von grH), aber nicht von anderen Granzymen, insbesondere GZMB, auf der mRNA-Ebene in lizensierten NK-Zellen höher war als in nichtlizensierten. Die vorgelegte Studie bestätigt durch Vielfarbdurchflusszytometrie diese Korrelation auf der Proteinebene. Sie ist im Hinblick auf mehrere verschiedene Paare inhibitorischer Rezeptoren (vor allem Killer-Cell Immunoglobulin-Like Receptors (KIRs)) und ihrer Liganden (vor allem humanes Leukozyten-Antigen (HLA)-C) statistisch so hochsig-nifikant, dass die Verwendung von grH-Expression für die Erstellung eines neuen zeit- und entwick-lungsorientierten Modells der NK Zell-Lizensierung, ebenso als Marker dafür, vorgeschlagen wird. Eine Korrelation zwischen NK Zell-Lizensierung und grB-Expression auf der Proteinebene war weniger deutlich und für grA oder grK nicht vorhanden. Sowohl grH- als auch grB-Expression korrelierten au-ßerdem positiv mit der NK Zell-Reife. GrH-Expression korrelierte negativ mit der Expression von KLRG1, eines in NK Zell-Adhäsion involvierten inhibitorischen Rezeptors, und es wird gezeigt, dass der Lizensierungsstatus einer NK Zelle aus grH-Positivität, CD57-Positivität und KLRG1-Negativität vorhergesagt werden kann. Außerdem wurde die Expression (Proteinebene) von grH und grB in Lym-phozyten untersucht und verglichen. In Ruhe war sie sehr ähnlich; am höchsten in NK Zellen, dann in absteigender Folge in NK-ähnlichen T Zellen, CD8+ T Zellen, CD4+ T Zellen und nicht-NK/nicht-T Lymphozyten. Insgesamt war die Expression von grB höher als von grH, auch in den untersuchten NK Zell-Subtypen, bis auf adaptive NK Zellen von Spendern, die eine Cytomegalovirus-assoziierte Expan-sion des NK Zell-Rezeptors NKG2C aufweisen; hier war die Expression von grH mindestens gleich der von grB. Nach NK Zell-Stimulation war die Expression von grH und grB jedoch unterschiedlich. Sti-mulation durch Interleukin (IL)-2 und/oder IL-15, oder IL-15 und den anti-CD20 monoklonalen Anti-körper (mAb) Rituximab, oder durch K562 Targetzellen, führte zu einer drastischen Reduktion der Ex-pression von grH, aber nicht grB. Außerdem zeigten sich nach Stimulation mit K562 Targetzellen An-stiege in der Expression von CD107a, Interferon- und Tumornekrosefaktor- als erhöht in grH– ver-glichen mit grH+ NK Zellen (lizensiert sowie nichtlizensiert), wohingegen keine Differenz zwischen grB– und grB+ Zellen bestand. ‚GrH Erschöpfung‘, in der nach NK Zell-Stimulierung grH ausgeschüttet, jedoch wegen verringerter Transkription nicht nachproduziert wird, könnte ein potenzieller Mechanis-mus für diese Phänomene sein. Ferner wurde die bislang vorgeschlagene mögliche zytotoxische Rolle von grH hier nicht bestätigt. Es gab keinen Unterschied in der Lyse von Targetzellen zwischen grH-überexprimierenden NK-92 Zellen und Kontrollen. Jedoch korrelierte die Expression von grH positiv mit der des antiapoptotischen BCL-2 in primären NK Zellen, was eine mögliche Funktion von grH im Überleben der es exprimierenden Zellen zeigt. Erstaunlicherweise war der häufig verwendete anti-grB mAb GB11 nicht grB-spezifisch, sondern kreuzreaktiv mit grH in grH-überexprimierenden K562 Zel-len. Hinsichtlich der starken Korrelation zwischen Lizensierungsstatus und der Transkription von GZMH im Gegensatz zu GZMB, sowie der fehlenden Unterscheidung zwischen grB und grH durch den häufig verwendeten anti-grB mAb, muss die Rolle von Granzymen im Lizensierungsprozess neu definiert werden. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass grH-Expression positiv mit NK Zell-Li-zensierung korreliert; so stark, dass sie die Basis eines neuartigen zeit- und entwicklungsorientierten Modells dieses Prozesses bilden kann. Die zuvor gezeigte Korrelation zwischen NK Zell-Lizensierung und grB-Expression wird infrage gestellt. Überdies wird statt einer zytotoxischen Rolle von grH, die hier nicht bestätigt werden konnte, eine Rolle des Proteins im Überleben der es exprimierenden Zellen suggeriert. Eine Reduktion in der Expression von grH, jedoch nicht von grB, wurde nach Stimulierung beobachtet und auf grH Erschöpfung zurückgeführt. Somit wird hier eine potenzielle regulatorische und nicht hauptsächlich zytotoxische Rolle des grH vorgeschlagen; die Verringerung in grH-Expression nach NK Zell-Stimulierung könnte dazu beitragen, NK Zell-Autoreaktivität zu vermeiden. Natural Killer (NK)-cell education is a process by which functional competence is acquired through engagement of self-specific inhibitory receptors, those cells that lack self-specific inhibitory receptors becoming hyporesponsive. It is well known that this process occurs, but the intracellular mechanisms, as well as phenotypic differences between educated and uneducated NK cells, remain largely elusive. Recently, granzyme (gr) B, one of the crucial effector molecules of NK cells, was shown to be more highly expressed, at the protein level, in licensed than unlicensed cells. Another human granzyme, grH, shares considerable sequence and structural identity with grB but is far less well-studied. Therefore, a link between the crucial NK-cell education and grH expression was sought, and an analysis of grH expression patterns and its function was conducted. In preliminary experiments Prof. Dr M. Uhrberg’s group, Düsseldorf, in cooperation with Prof. Dr L. Walter’s group, Göttingen, found that mRNA levels of GZMH (gene name of grH), but not of other granzymes, including GZMB, were higher in licensed than unlicensed NK cells. The present study now confirms this correlation at the protein level using multicolour flow cytometry. The correlation is highly statistically significant for several different inhibitory receptor (mainly killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIRs)) / ligand (mainly human leukocyte antigen (HLA)-C) pairs, and so strong that use of grH expression to formulate a novel temporal and developmental model of NK-cell licensing, and also as a marker of the process, is proposed. A correlation between NK-cell licensing and grB expression at the protein level was less clear, and none was found for grA or grK. Both grH and grB expression also positively correlated with NK-cell maturity. GrH expression negatively correlated with KLRG1, an inhibitory receptor involved in NK-cell adhesion, and an NK cell’s licensing status is shown to be predictable from grH-positivity, CD57-positivity and KLRG1-negativity. GrH and grB protein expression by lymphocytes was also examined and compared. It was found to be very similar at rest, highest in NK cells, then in descending order in NK-like T cells, CD8+ T cells, CD4+ T cells and non-NK/non-T lymphocytes. Overall, expression of grB was higher than of grH, including in all NK-cell subtypes tested, except for adaptive NK cells from donors with a cytomegalovirus-associated expansion of the NK-cell receptor NKG2C, in which grH levels were at least equal to grB’s. Upon NK-cell stimulation, grH and grB expression were different, however. Stimulation with interleukin (IL)-2 and/or IL-15, or IL-15 and the anti-CD20 monoclonal antibody (mAb) rituximab, or with K562 target cells, led to drastic reductions in grH but not grB levels. Furthermore, following stimulation with K562 cells, increases in expression of CD107a, interferon- and tumour necrosis factor-, were higher in grH– than grH+ NK cells (both licensed and unlicensed), while no difference was observed between grB– and grB+ cells. ‘GrH exhaustion’, where grH is excreted upon NK-cell stimulation but, due to reduced transcription, is not replenished, could be a possible mechanism for these phenomena. The previously suggested putative cytotoxic role of grH could not be confirmed here. There was no difference in target-cell lysis between grH-overexpressing NK-92 cells and controls. However, primary NK-cell grH expression positively correlated with that of the anti-apoptotic BCL-2, possibly implicating grH in host-cell survival. Notably, the commonly used anti-grB mAb GB11 was shown to be non-specific for grB, cross-reacting with grH in grH-overexpressing K562 cells. Considering that in contrast to GZMB, transcription of GZMH strongly correlated with licensing status, and considering that the commonly used anti-grB mAb did not distinguish between grB and grH, the role of granzymes in the licensing process has to be redefined. In sum, this study shows grH expression to be positively correlated with NK-cell licensing, strongly enough so to form the basis of a new temporal and developmental model of the process. In contrast, the previously shown correlation between grB and NK-cell licensing is challenged. Furthermore, instead of a possible cytotoxic role of grH, which could not be confirmed here, a role of grH in host-cell survival is suggested. Moreover, a decrease in grH expression upon stimulation was observed, which stands in contrast to the steady or even increased grB expression and may be due to grH exhaustion. Thus, the author proposes a potential regulatory rather than a mainly cytotoxic role of grH, the decrease in grH expression upon NK-cell stimulation possibly helping to prevent NK-cell autoreactivity.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	22.04.2021
Dateien geändert am:	22.04.2021
Promotionsantrag am:	29.08.2020
Datum der Promotion:	15.04.2021