Dokument: Attenuation of VEGFR3 activity by intracellular versus extracellular mechanisms

Titel:	Attenuation of VEGFR3 activity by intracellular versus extracellular mechanisms
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55916
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20220429-091201-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hilger, Laura Sophie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,76 MB in 2 Dateien [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.04.2021 / geändert 06.04.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter] Prof. Dr. Gödecke, Axel [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Lymphgefäße regulieren und stabilisieren den körpereigenen Wasserhaushalt und tragen zur Drainage und Entgiftung des Gehirns bei. Durch ihre vielschichtigen Aufgaben sind Krankheitszustände wie Lymphödeme, Krebs und neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Alzheimer mit der Funktionalität der Lymphgefäße assoziiert. Die Entstehung und das Wachstum der Lymphgefäße (Lymphangiogenese) ist – unabhängig von Gesundheitszustand und Alter – ein wichtiger Prozess, um die Funktionalität der Lymphgefäße zu gewährleisten. Kontrolliert wird dieser Vorgang hauptsächlich über den vaskulären endothelialen Wachstumsrezeptor 3 (VEGFR3). Dieser ist hauptsächlich auf lymphatischen Endothelzellen (LEZ) exprimiert und induziert nach seiner Aktivierung und Phosphorylierung die Proliferation der LEZ. Die Phosphorylierung des VEGFR3 kann sowohl durch die Bindung der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren C und D (VEGF-C und VEGF-D) als Liganden an den VEGFR3, als auch durch mechanische Reize aktiviert werden. Letztere werden durch Mechanorezeptoren wie β1 Integrin empfangen und über entsprechende Interaktionen an den VEGFR3 weitergeleitet. Um ein übermäßiges Wachstum der Lymphgefäße aufgrund von unkontrollierten Signalen durch den VEGFR3 zu vermeiden, muss die Aktivität des Rezeptors kontrolliert werden. Diese Arbeit zielte auf die Identifikation von Mechanismen ab, welche die Signalaktivität des VEGFR3 im physiologischen Zustand abschwächen und somit regulieren. Dabei konnte sowohl ein intrazellulärer, als auch ein möglicher extrazellulärer Mechanismus aufgedeckt werden. Auf intrazellulärer Seite ist der sogenannte IPP Komplex, bestehend aus der ‚integrin linked kinase‘ (ILK), dem ‚particularly interesting new cystein-rich protein‘ (PINCH) und parvin, besonders interessant. Im IPP Komplex bildet ILK das Zentrum und bindet an den Mechanorezeptor β1 Integrin. Die Reduktion des Proteingehalts von ILK, durch den Einsatz von siRNAs in adulten humanen LEZ, resultierte sowohl in signifikant erhöhten Interaktionen zwischen β1 Integrin und VEGFR3, als auch in stark erhöhter VEGFR3 Phosphorylierung. Als Folge dessen, konnte auch eine stark erhöhte Proliferationsrate der LEZ beobachtet werden, welche mit sehr wenig ILK Protein auskommen mussten. Vergleichbare Effekte wurden durch das mechanische Strecken der LEZ erzielt, wobei nicht nur erhöhte Interaktionen zwischen β1 Integrin und VEGFR3, sondern auch signifikant verringerte Interaktionen zwischen ILK und β1 Integrin beobachtet werden konnten. Während bei diesem Prozess die Gesamtproteinmenge von ILK nahezu unverändert blieb, sank der Proteingehalt von ILKs Komplexpartner α-parvin jedoch signifikant ab. Da die Gesamtproteinmenge von α-parvin auch in den LEZ reduziert wurde, welche mit siRNAs gegen ILK behandelt wurden, wurde anschließend eine Beteiligung von α-parvin an der Regulation der VEGFR3 Signalwege geprüft. Auch die Reduktion der α-parvin Proteinmenge durch den Einsatz von siRNAs löste einen leichten Anstieg der VEGFR3 Phosphorylierung, sowie einen signifikanten Anstieg der LEZ Proliferation aus. Somit konnten sowohl ILK, als auch α-parvin als Teil eines intrazellulären Mechanismus für die Abschwächung der VEGFR3 Signalaktivität in adulten, humanen LEZ identifiziert werden. Auf der anderen Seite konnte in dieser Thesis das sogenannte ‚β-site of amyloid precursor protein cleaving enzyme 2‘ (BACE2) als Teil eines möglichen extrazellulären Mechanismus der Abschwächung der VEGFR3 Signalaktivität in LEZ identifiziert werden. Die Aktivität der BACE Proteasen wurde als einflussnehmend auf die Entwicklung von Morbus Alzheimer und Typ 2 Diabetes mellitus beschrieben. Der erste Hinweis auf eine mögliche Beteiligung von BACE2 an der Regulation der VEGFR3 Signalaktivität wurde durch die unspezifische pharmakologische Inhibition der BACE Proteasen in adulten humanen LEZ erhalten. Diese resultierte in einer gesteigerten VEGFR3 Gesamtproteinmenge, sowie einer signifikant erhöhten VEGFR3 Phosphorylierung und LEZ Proliferation. Sowohl die selektivere pharmakologische BACE1 Inhibition, als auch die Reduktion der BACE1 Proteinmenge mittels des Einsatzes von siRNAs, zeigten jedoch keinen Effekt auf VEGFR3 oder die LEZ Proliferation. Im Gegensatz dazu, resultierte die gezielte Reduktion der BACE2 Proteinmenge über den Einsatz von siRNAs in einer gesteigerten VEGFR3 Phosphorylierung und LEZ Proliferation. Diese Ergebnisse deuten auf eine Beteiligung von BACE2, nicht aber BACE1, am Mechanismus der extrazellulären Abschwächung von VEGFR3 Signalen hin. Zusammenfassend beschreibt diese Thesis, wie ILK und α-parvin Teil eines intrazellulären Mechanismus und BACE2 Teil eines extrazellulären Mechanismus für die Abschwächung der VEGFR3 Signalaktivität sind. Auf diesem Weg nehmen beide Mechanismen Einfluss auf die Proliferation humaner LEZ und somit möglicher Weise auch auf die humane Lymphangiogenese. Darüber hinaus konnte diese Arbeit auf mögliche Nebenwirkungen der gegen Morbus Alzheimer entwickelten BACE1 Inhibitoren hinweisen, welche bislang auch BACE2 inhibieren. Somit ist es möglich, dass der Einsatz dieser Inhibitoren Einfluss auf die Funktionalität der Lymphgefäße nimmt, welche wichtig für die Drainage und Entgiftung des Gehirns und somit auch für dessen Funktionalität sind. The lymphatic vascular system maintains the body’s fluid homeostasis and accounts for brain drainage and detoxification. Due to its multiple functions, the lymphatic system is associated to pathologic conditions like lymphedema and cancer, but also to neurodegenerative diseases like Alzheimer’s disease. Regardless of the state of health, lymphangiogenesis – the formation and growth of lymphatic vessels from preexisting ones – is required in both the embryonic and the adult body. Lymphangiogenesis is mainly driven by phosphorylation and signaling of the vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGFR3) in lymphatic endothelial cells (LECs). VEGFR3 phosphorylation can be activated by ligand binding of vascular endothelial growth factors C and D (VEGF-C and -D), as well as via mechanical stimulation sensed and translated by e.g. β1 integrin. Since excessive VEGFR3 signaling might cause non-physiologic LEC proliferation and lymphatic overgrowth, it requires strict regulation. This study focused on the identification of mechanisms facilitating the attenuation of VEGFR3 activity in quiescent adult human LECs and thereby uncovered both extracellular and intracellular ones. In detail, the ILK-PINCH-parvin (IPP) complex proved to be an intracellular regulator of VEGFR3 signaling as it binds to β1 integrin and thereby attenuates interactions between β1 integrin and VEGFR3. Silencing of the integrin-linked kinase (ILK) as the central part of the IPP complex significantly stimulated interactions between β1 integrin and VEGFR3, followed by significantly increased VEGFR3 phosphorylation and LEC proliferation. In addition, silencing of ILK significantly decreased the protein levels of its complex partner α-parvin. Supporting these results, mechanical stimulation of adult human LECs decreased the interactions between ILK and β1 integrin and further caused a significant decrease in α-parvin protein levels. Notably, silencing of PARVA in adult human LECs also resulted in slightly increased VEGFR3 phosphorylation and increased LEC proliferation, supporting the role of α parvin in this intracellular mechanism for attenuation of VEGFR3 signaling in quiescent adult human LECs. The β-site of amyloid precursor protein cleaving enzyme 2 (BACE2) on the other hand transpired to be a potential extracellular regulator of VEGFR3 signaling. BACE proteases are required for amyloid production, which forms oligomers or plaques involved in the development and worsening of Alzheimer’s disease and type 2 diabetes mellitus. The unspecific pharmaceutical inhibition of BACE proteases in adult human LECs increased total VEGFR3 levels, as well as VEGFR3 phosphorylation and LEC proliferation. More selective inhibition of BACE1, as well as BACE1 silencing via siRNAs did not lead to the described effects. In comparison, BACE2 silencing was sufficient to increase VEGFR3 phosphorylation and LEC proliferation. Thus, rather BACE2 than BACE1 might be part of an extracellular mechanism causing attenuation of VEGFR3 signaling in quiescent adult human LECs. In summary, this thesis describes ILK and α-parvin as parts of an intracellular mechanism, and BACE2 as a potential part of an extracellular mechanism which both attenuate VEGFR3 activity in quiescent adult human LECs. Thereby, the named candidates prevent LECs from non-physiologic proliferation. The obtained results are linked to pathological conditions such as lymphedema and Alzheimer’s disease. The results obtained from silencing of BACE2 further point to potential adverse effects of unselective BACE1 inhibition, unintentionally affecting BACE2 during the treatment of Alzheimer’s disease. The results point into the direction that BACE2 inhibition might impact the functionality of lymphatic vessels, which is especially important for brain drainage and detoxification.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	29.04.2022
Dateien geändert am:	29.04.2022
Promotionsantrag am:	03.11.2020
Datum der Promotion:	15.03.2021