Dokument: Gezielte Sequenzierung von USP8 bei PatientInnen mit Morbus Cushing und Genome Editing in HAC15 Zellen mittels CRISPR/Cas9

Titel:	Gezielte Sequenzierung von USP8 bei PatientInnen mit Morbus Cushing und Genome Editing in HAC15 Zellen mittels CRISPR/Cas9
Weiterer Titel:	Targeted Sequencing of USP8 in patients with Cushing's disease and Genome Editing in HAC15 cells using CRISPR/Cas9
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55852
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210406-094742-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ballmann, Cora [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,37 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.03.2021 / geändert 26.03.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Ute Scholl [Gutachter] Prof. Dr. Matthias Schott [Gutachter]
Stichwörter:	USP8, KCNJ5, CACNA1D, Morbus Cushing, Primärer Hyperaldosteronismus, CRISPR/Cas9, Genome Editing, Next Generation Sequencing
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Zusammenfassung Teile dieser Arbeit wurden in der Arbeit Ballmann et al. 20181 veröffentlicht. In der folgenden Darstellung werden Teile aus der genannten Arbeit 1 in wörtlicher Übersetzung verwendet. Eine häufige Ursache sekundären Bluthochdrucks stellen endokrine Krankheitsbilder dar. Dabei spielen somatische Mutationen in endokrinen Tumoren eine wichtige Rolle. Die vorliegende Doktorarbeit befasst sich mit KCNJ5- und CACNA1D-Mutationen als Ursache eines primärem Hyperaldosteronismus (PA), sowie mit USP8-Mutationen als Ursache eines Morbus Cushing. Kürzlich wurden somatische Gain-of-function-Mutationen im USP8-Gen corticotroper Adenome als Ursache eines Morbus Cushing identifiziert. Eine molekulare Diagnostik könnte eine hilfreiche Ergänzung der Standarddiagnostik sein und zukünftig bestenfalls eine spezifische Therapie zur Konsequenz haben. Häufig, insbesondere bei kleineren Adenomen, liegt kein frisches Gewebe für eine solche Diagnostik vor, und oft kommt es zu einer Kontamination mit Normalgewebe. In dieser Arbeit testeten wir deshalb DNA aus Formalin-fixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe von 42 Hypophysenadenomen von PatientInnen mit Morbus Cushing (27 weibliche und 15 männliche PatientInnen; mittleres Alter bei OP, 42,5 Jahre; mittlere Tumorgröße, 12,2 mm). Mittels Sanger Sequenzierung identifizierten wir vorher beschriebene somatische Mutationen in sechs (Mutationsfrequenz, 14,3 %) der Adenome. Mit Hilfe von gezieltem Next-Generation Sequencing (NGS) konnten bekannte, sowie bislang unbeschriebene Mutationen in drei weiteren Adenomen (zwei mit jeweils zwei Mutationen) mit Allelfrequenzen von bis zu lediglich 3 % identifiziert werden. Sieben von neun (Gesamtmutationsfrequenz, 21,4 %) mutierten Adenomen stammten von weiblichen Patientinnen (Mutationsfrequenz, 25,9 %) und zwei von männlichen Patienten (Mutationsfrequenz, 13,3 %). Die durchschnittliche Größe der Adenome mit USP8- Mutation betrug 11,4 mm, und das durchschnittliche Alter der zugehörigen PatientInnen lag bei 43,9 Jahren. Insgesamt lag unsere Mutationsfrequenz etwas unter den Frequenzen in zuvor publizierten Studien. Aktuellere Studien geben teils jedoch ähnliche Mutationsfrequenzen an. Zudem ermittelten wir keine Deletionen, welche in anderen Kohorten häufig beschrieben wurden. Wir konnten in dieser Arbeit erfolgreich DNA aus kleinen Mengen FFPE Gewebe isolieren und zeigen, dass NGS eine höhere Sensitivität für die Detektion von USP8-Mutationen aufweist als Sanger Sequenzierung. Die Ermittlung des USP8-Mutationsstatus mittels dieser Methode könnte zu- künftig eine sinnvolle Ergänzung der histopathologischen Diagnostik darstellen. Mutationen im CACNA1D- und KCNJ5-Gen kommen in über der Hälfte aller Aldosteron produ- zierender Adenome (APA) vor. Die aktuelle Therapie der Wahl stellt eine operative Entfernung des Adenoms dar. Um den Pathomechanismus zu untersuchen und alternative therapeutische Optionen testen zu können, sind Zellmodelle von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wurde mittels CRISPR/Cas9, einer neuen Methode, gezieltes Genome Editing durchgeführt. Ziel war es, ein Knockin der häufigsten KCNJ5-Mutation G151R und der CACNA1D-Mutation I770M in das Genom der Aldosteron produzierenden Zelllinie HAC15 zu erzielen. Nachdem das erfolgreiche Knockin zwei homozygoter I770M-Mutationen und die Erzeugung von 110 (90,9 %) Insertionen und/oder Deletionen (Indels) in der schnellwachsenden Testzelllinie HEK293 gelang, erfolgte die Transfektion von HAC15 Zellen und die Isolation von 164 Klonen. In 121 (73,8 %) der transfizierten HAC15 Zellklone konnte eine Indel identifiziert und somit erfolgreiches Genome Editing durchgeführt werden. Eine I770M oder G151R Mutationen konnte in keinem der HAC15 Zellklone identifiziert werden. Während es trotz unterschiedlichster Anpassungen des Versuchsaufbaus im Rahmen dieser Arbeit demnach nicht gelang, ein gezieltes Knockin durchzuführen, konnte dagegen die Erzeugung von Knockouts in HAC15 Zellen mittels CRISPR/Cas9 erfolgreich etabliert werden. 37 der Zellklone (davon 22, die mit einem CACNA1D-Konstrukt und 15, die mit einem KCNJ5-Konstrukt transfiziert wurden) wiesen eine homozygote Indel auf, welche zu einer Leserasterverschiebung mit Einbau eines vorzeitigen Stopp-Codons führte. Die erzeug- ten KCNJ5- bzw. CACNA1D-Knockoutzelllinien können für funktionelle Studien verwendet wer- den, die beispielsweise die Aldosteronproduktion untersuchen. Abstract Endocrine diseases are a frequent cause of secondary hypertension. In this context, somatic mutations in endocrine adenomas play an important role. This doctoral thesis covers KCNJ5 and CACNA1D mutations previously described in patients with primary aldosteronism (PA) as well as USP8 mutations in patients with Cushing’s disease. Recently, somatic mutations in the USP8 gene were identified in approximately one third of pituitary adenomas from patients with Cushing’s disease. Molecular testing of USP8 might complement the diagnosis of Cushing’s disease in the future and potentially have therapeutic implications. However, tissue is sparse after mutations in six of 42 adenomas (transsphenoidal surgery and typically fixed for histopathology. Thus, fresh tissue is usually not available, especially when tumors are very small. What is more, contamination with normal tissue is frequent. We here tested DNA isolated from single formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections of 42 pituitary adenomas. All adenomas were from patients with Cushing’s disease (27 female and 15 male; mean age at surgery, 42.5 years; mean tumor size, 12.2 mm). By Sanger sequencing, we identified previously described mutation frequency, 14.3 %). Performing targeted next-generation sequencing, we detected somatic mutations in three additional adenomas (overall mutation frequency, 21.4 %), with mutant allele frequencies as low as 3 %. Two of these adenomas carried two USP8 mutations each. While most mutations had been previously published, one had not been described before. Seven out of nine USP8 mutations occurred in adenomas from female patients (mutation frequency, 25.9 %) and two in male patients (mutation frequency, 13.3 %). The average size of mutated adenomas was 11.4 mm, while the mean age of the corresponding patients was 43.9 years. Compared to previous studies, our overall mutation frequency was lower, but some more recent studies showed similar overall mutations frequencies. Moreover, we did not identify deletions, which had been frequently observed in other cohorts. In summary, in this study, we successfully isolated DNA from single FFPE tissue sections of pituitary adenomas and demonstrated that targeted NGS has a higher sensitivity for identifying USP8 mutations than Sanger sequencing. Molecular testing of USP8 by targeted NGS might be a useful complement to histopathological diagnostics in future. Somatic mutations in the KCNJ5 or CACNA1D gene occur in more than half of all aldosterone- producing adenomas (APAs). The current first line treatment of APAs is adrenalectomy, the resection of the affected adrenal gland. Cell models could be important to examine the underlying pathomechanism and to test novel therapeutic options. Here, we performed targeted genome ed- iting using CRISPR/Cas9. The aim of this study was to introduce the most common KCNJ5 mutation G151R and the CACNA1D mutation I770M into the genome of the aldosterone-producing human adrenocortical cancer cell line HAC15. After the successful knockin of two homozygous I770M mutations and the generation of 110 (90.9 %) indels in the test cell line HEK293, HAC15 cells were transfected, and 164 individual clones were obtained. In 121 (73.8 %) of the transfected HAC15 clones, an indel was identified, thus the residues had been successfully targeted. No clones with I770M or G151R mutations were identified despite various adjustments of the exper- imental setup. However, homozygous KCNJ5 and CACNA1D knockouts in HAC15 cells using CRISPR/Cas9 were established. 37 clones (22 transfected with a CACNA1D construct, 15 transfected with a KCNJ5 construct) showed a homozygous indel, which resulted in a frameshift mutation followed by a premature stop codon. The generated KCNJ5 and CACNA1D knockout cell lines may be useful for future functional studies, for example on aldosterone production.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	06.04.2021
Dateien geändert am:	06.04.2021
Promotionsantrag am:	12.08.2020
Datum der Promotion:	23.03.2021