Dokument: Die microRNA-30e als Entscheidungsträger in strahlungsinduzierten Signalwegen
| Titel: | Die microRNA-30e als Entscheidungsträger in strahlungsinduzierten Signalwegen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55816 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210329-113309-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Reese, Alina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jänicke, Reiner [Gutachter] Prof. Dr. Wesselborg, Sebastian [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das Auftreten einer DNA-Schädigung in einer Zelle aktiviert eine komplexe Signalkaskade, in deren Zentrum der Tumorsuppressor p53 steht. So ist die Zelle durch diesen Transkriptionsfaktor in der Lage die Reparatur der DNA oder, falls die Schädigung zu massiv sein sollte, einen permanenten Zellzyklusarrest (Seneszenz) oder ihre Eliminierung durch den programmierten Zelltod zu veranlassen. Neben unzähligen Zielproteinen gehören zum p53-Regelnetzwerk auch microRNAs (miRNAs), die als nicht-kodierende RNAs auf zahlreichen Ebenen der DNA-Schädigungsantwort eingreifen. Im Fokus der vorliegenden Forschungsarbeit steht die miR-30e, deren Hochregulation spezifisch in der strahlungsinduzierten p53/p21-abhängigen Seneszenz, nicht aber in p53-defizienten apoptotischen Zellen kürzlich von unserem Labor nachgewiesen wurde. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der miR-30e in strahlungsinduzierten Signalwegen näher zu charakterisieren und ihre Ziel-mRNAs zu identifizieren. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass p53 den miR-30e-Promotor transkriptionell induziert und die miRNA damit als direktes Zielgen eingestuft werden kann. In DNA-Schädigungsantworten übte die Überexpression von miR-30e in HCT116 Wildtyp-Zellen einen anti-apoptotischen sowie pro-seneszenten Einfluss auf das Zellschicksal aus. Auf molekularer Ebene war dies zum einen auf die verminderte Expression der pro-apoptotischen Procaspase-3 und damit verbunden mit einer deutlich verringerten Caspase-3-Aktivierung zurückzuführen. Zum anderen war unter diesen Bedingungen eine Hochregulation von p21 zu beobachten. Die verstärkte p21-Expression nach Bestrahlung wurde dabei sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene festgestellt. Der Anstieg der p21-Expression beruht dabei nicht auf einer miR-30e-abhängigen Stabilisierung der p21 mRNA, sondern auf der transkriptionellen Aktivierung des p21-Promotors. In weiteren Untersuchungen konnte die durch miR-30e-induzierbare Promotorregion auf 600 bp eingegrenzt werden. Da eine Interaktion von miR-30e mit genomischer DNA nicht bekannt ist, ist ein indirekter Regulationsmechanismus als sehr wahrscheinlich anzusehen. Dieser könnte z.B. auf einer miR-30e-vermittelten Repression inhibitorischer Transkriptionsfaktoren beruhen. Während sich massenspektrometrische Analysen zur Identifizierung solcher Transkriptionsfaktoren sowohl in Kernextrakten als auch in Immunpräzipitaten als zu insensitiv erwiesen, konnte durch einen ELISA-ähnlichen Transkriptionsfaktor-Aktivitätstest MEF2D als Ziel-mRNA von miR-30e identifiziert werden. So demonstrierten RNA-Interferenzstudien, dass MEF2D die Seneszenzinduktion nach Bestrahlung verringert. MEF2D scheint dementsprechend ein vielversprechender Kandidat für eine miR-30e-induzierte p21-Expression zu sein. Eine weitere Charakterisierung konnte aus zeitlichen Gründen im Rahmen dieser Dissertation nicht mehr durchgeführt werden. Letztendlich gelang es aber mit Hilfe der CRISPR/CAS9-Technik spezifische miR-30e-Knockdown-HCT116 Zellklone zu generieren und diese auch initial zu charakterisieren. Diese Zellen werden in Zukunft für die weitere Eruierung von miR-30e-Funktionen und der Identifizierung und Verifizierung von direkten Ziel-mRNAs und den dadurch beeinflussten Signalwegen von großer Bedeutung sein. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass miR-30e ein wichtiger Regulator des p53-p21-Signalwegs ist und das Zellschicksal nach Bestrahlung moduliert, indem verstärkt Seneszenz ausgelöst wird.Following DNA damage, cellular signaling pathways become initiated to maintain genomic integrity including DNA repair, apoptosis and senescence. Key regulator in all these pathways is the tumor suppressor p53 controlling a complex signaling network which includes, among others, microRNAs. Recently, miR-30e was identified by our laboratory to be specifically upregulated in p53-proficient HCT116 wildtype cells that upon exposure to ionizing radiation (IR) are driven into senescence. In apoptotic p53-deficient cells, however, IR failed to increase miR-30e expression. The present study investigated the function of miR-30e in radiation-induced signaling pathways, particularly with regard to the identification of underlying molecular mechanisms and target mRNAs.
Here, it was shown that p53 enhanced miR-30e promotor activity, thereby confirming miR-30e as a direct transcriptional target of p53. Overexpression of miR-30e demonstrated its capability to modulate DNA damage-induced cell fate decisions in HCT116 wildtype-cells. On the one hand, miR-30e displays an anti-apoptotic activity by downregulating procaspase-3 expression, thereby preventing cell death in response to IR. On the other hand, and most importantly, miR-30e accelerates induction of senescence by increasing p21 expression. As p21 upregulation was observed at protein and mRNA level, a translational effect was excluded. Further, as miR-30e binds neither directly to p21 mRNA nor affects its stability, it appears that this miR activates p21 expression at the transcriptional level. Indeed, miR-30e enhances p21-promotor activity without requiring p53. More precisely, the presence of a 600 bp region of the p21-promotor was identified to be required for miR-30e to induce p21 expression. However, miRNAs primarily repress gene expression by inhibiting translation or mediating mRNA decay. In light of this, miR-30e most likely controls p21 upregulation indirectly by regulating a yet unknown transcription factor. Although massspectrometric analyses were too insensitive to allow detection of transcriptions factors in nuclear extracts or DNA-pulldown samples, utilizing an ELISA-like transcription factor activity test, MEF2D was identified as a target of miR-30e. RNA interference studies using siRNAs directed against MEF2D revealed a reduced onset of senescence after irradiation. Therefore, MEF2D might be involved in miR-30e-dependent upregulation of p21, and consequently in the induction of senescence. Unfortunately, constraints did not allow the investigation of a direct involvement of MEF2D in these processes. However, using the CRISPR/CAS9-system, HCT116 miR-30e-knockdown cell lines were generated. These cell lines can be used in the future for a more detailed characterization of their properties particularly with regard to their p53-dependent cell fate decisions, as well as for the identification and validation of miR-30e targets. In summary, the present study clearly highlights the importance of miR-30e-mediated regulation of the p53-p21-pathway with regard to directing cell fate, upon irradiation, towards senescence. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 29.03.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 29.03.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 06.10.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 23.02.2021 |
