Dokument: Introducing catechols into sequence-defined macromolecules to control adhesion to organic and inorganic surfaces
| Titel: | Introducing catechols into sequence-defined macromolecules to control adhesion to organic and inorganic surfaces | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55712 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210318-143349-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Fischer, Jan Lukas Ruben [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Laura Hartmann [Gutachter] PD Dr. Klaus Schaper [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Katechole sind vor allem bekannt für ihre wichtige Rolle bei der einzigartigen Fähigkeit von
Meeresmuscheln, sich im Wasser und in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen stark an verschiedenen Oberflächen anhaften zu können. Dazu sekretieren die Muscheln einen Byssalfaden, der aus verschiedenen Proteinen besteht, die mit der Oberfläche in Kontakt kommen, den so genannten Muschelfußproteinen (Mfps). Diese Proteine bestehen zu einem hohen Anteil aus der posttranslational modifizierten Aminosäure L-DOPA, die als Seitenkette einen Katecholrest aufweist und für die außergewöhnlichen Hafteigenschaften verantwortlich gemacht wird. Katechole sind nicht nur wegen ihres einzigartigen Nassklebepotentials interessant. Ihre chemischen Eigenschaften - die langsame Oxidation unter basischen Bedingungen und die anschließende Reaktion mit Nukleophilen wie Aminen oder Thiolen - machen sie auch zu potentiell reaktiven Komponenten für den Einsatz z.B. in irreversibel bindenden glykomimetischen Liganden. In der Natur werden diese biologischen Makromoleküle wie Proteine oder Glykoliganden mit hoher Kontrolle über Sequenz und Positionierung funktioneller Seitenketten oder interagierender Einheiten synthetisiert. Daher führt diese Arbeit nun Katecholeinheiten in eine neue Klasse von biomimetischen Makromolekülen ein, den so genannten Präzisionsmakromolekülen. Die Arbeitsgruppe von Prof. Hartmann hat kürzlich eine Synthese für Präzisionsmakromoleküle entwickelt, die Festphasen-Polymersynthese (SPPoS) für sequenzdefinierte Oligo(amidoamine). Diese Synthese basiert auf der Merrifield-Peptidsynthese und verwendet maßgeschneiderte Bausteine, die eine freie Säure und ein Fmoc-geschütztes Amin sowie eine funktionelle Seitenkette aufweisen. Diese Arbeit konzentrierte sich auf die Entwicklung neuer Protokolle auf der Basis von SPPoS zur Einführung von Katecholresten in sequenzdefinierte Oligo(amidoamine) zur Synthese biomimetischer Strukturen, die die Katecholbindung sowohl an anorganische Oberflächen als auch an Proteinen untersuchen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine neue Synthesestrategie entwickelt, die einen schnelleren und effizienteren Zugang zu Bausteinen ermöglicht. Durch die Einführung einer Ein-Topf-Reaktion für die selektive Einführung von Fmoc und funktioneller Seitenkette wird eine vorher stattfindende Umlagerung umgangen, drei synthetische Schritte konnten gespart und die Ausbeute drastisch erhöht werden. Mit Hilfe dieser verbesserten Synthese konnten zwei neue Bausteine synthetisiert werden: der Methylether-geschützte, Katechol präsentierende Baustein CDS (Catechol-Diethylentriamin-Bernsteinsäure) und der Trityl geschützte Amin-Baustein TrDS (Trityl-Diethylentriamin-Bernsteinsäure). Für den CDS Baustein wurde eine selektive Spaltung des Methylethers in Gegenwart von aliphatischem Rückgratether unter Verwendung von Trifluormethansulfonsäure und Thioanisol zur Entschützung entwickelt. Mit dem Baustein TrDS wurde die Synthese von tertiären Amin- und primären Amidstrukturen durch Entfernung der Trityl-Gruppe am Harz und anschließende Amidkupplung mit der gewünschten Funktionalität etabliert. Unter Anwendung der entwickelten Methoden wurden zwei Klassen von Katechol funktionalisierten Präzisionsmakromolekülen synthetisiert. Zunächst wurden Präzisionsmakromoleküle synthetisiert, die durch die adhäsiven Eigenschaften von Muscheln inspiriert wurden und Katechole und kationische Anteile kombinieren. Obwohl ein dritter Anteil gewöhnlich in Mfps mit Oberflächenkontakt zu finden ist, das primäre Amid der Seitenkette von Asparagin, wurde dessen Einfluss auf die Haftfestigkeit bisher nicht untersucht und nun erstmals in dieser Studie einbezogen. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Sequenz bei synthetischen Systemen noch nicht berücksichtigt und nun für Katechol funktionalisierte Präzisionsmakromoleküle realisiert. Um die Auswirkungen von Zusammensetzung und Monomersequenz auf die Hafteigenschaften zu untersuchen, wurden in Zusammenarbeit mit Alexander Strzelczyk und Jun.-Prof. Dr. Stephan Schmidt alle Präzisionsmakromoleküle an sogenannten weichen kolloidalen Sonden (PEG-Mikrogele) angebracht und auf ihre Haftung an Glasoberflächen untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Kombination von Katechol mit einer der beiden anderen funktionellen Gruppen zu einem synergistischen Effekt und einer Erhöhung der Adhäsionsenergie führte, die höher war als die Summe seiner Einzelteile. Für das tertiäre Amin ist dies bereits bekannt und wird mit dem Potential der Amine erklärt, die Hydratationsschicht der Oberfläche aufzubrechen, um die Zugänglichkeit für das Katechol zu erhöhen. Allerdings wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal der signifikante Beitrag des primären Amids zur Nasshaftung und seine Synergie mit den Katecholen gezeigt. Darüber hinaus wurde ein starker Einfluss der Reihenfolge und des Abstands der Darstellung der funktionellen Gruppen gezeigt. Sowohl die Verringerung des Abstands zwischen Katechol und tertiärem Amin als auch die Präsentation des Katechols in größerer Nähe zur Oberfläche im Vergleich zum primären Amid führten zu einem drastischen Anstieg der Adhäsion und einem Verlust der pH-Abhängigkeit. In einem nächsten Schritt könnte dieses neue Wissen den Weg zu optimierten biomimetischen Klebstoffen für z.B. medizinische Klebstoffe ebnen, da es eine optimale Zusammensetzung und Präsentation der funktionellen Gruppen als Blaupause für neue Polymere zeigt. Für eine zweite Klasse von Katechol-funktionalisierten, sequenzdefinierten Oligo(amidoamine)n wurden Katechole in Präzisionsglykomakromoleküle eingebracht, um ihr Potenzial als reaktive Liganden zu untersuchen. Es ist bekannt, dass Glykomakromoleküle bakterielle Adhäsine spezifisch binden und dadurch ihre Adhäsion blockieren, was normalerweise der erste Schritt des Infektionsprozesses ist. Diese Bindung ist jedoch in hohem Maße reversibel. Um die Wirksamkeit des Inhibitors zu verbessern, könnte dies mit einer zusätzlichen kovalenten Bindungsbildung kombiniert werden, wie in dieser Arbeit durch die Einführung von Katecholresten untersucht wurde. Zusammen mit Ricarda Steffens während ihrer Masterarbeit wurde der Katecholanteil der Dihydrocaffeesäure Acetonid geschützt und an Glykomakromoleküle gekoppelt, die nach zuvor etablierten Protokollen des Hartmann-Labors zusammengestellt wurden. Mit Hilfe von Trübungs- und Fällungstests konnte gezeigt werden, dass die Kombination von Katecholen mit dem bindenden Kohlenhydrat Mannose die Affinität zu ConA verbesserte. Die Strukturen wurden auch in einem Adhäsions-Inhibitions-Assay mit lebenden Escherichia coli (E. coli) verwendet, bei dem das relative Inhibitionspotential (RIP) für die Adhäsion von E. coli gegenüber einer Mannan Oberfläche getestet wurde. Bei einer Inkubationszeit von einer Stunde ergaben sich ähnliche RIP-Werte wie bei zuvor getesteten Strukturen, aber die Erhöhung der Inkubationszeit auf 24 Stunden führte zu einer wirksamen Hemmung der Bakterienadhäsion, was auf eine Oxidation der Katecholreste und eine kovalente Bindung im Laufe der Zeit hindeutet. Diese kovalente Bindung wurde auch gegenüber ConA nachgewiesen, indem MALDI-TOF und SDS-PAGE gemessen wurden, die zusätzliche Massenpeaks zeigten, die der ConA-Untereinheit und dem Liganden entsprachen. Hier wirkte die Struktur mit einem Katechol auf jeder Seite der Kohlenhydrateinheiten als Klammer, um die Bindungsstelle von ConA wirksam zu blockieren, was die Bedeutung der Katecholpräsentation bewies. Wichtig ist, dass in allen Assays keine Wechselwirkung für die katecholhaltigen Galaktose-Oligomere gefunden wurde, was zeigt, dass die Spezifität der Kohlenhydrateinheit erhalten bleibt. Dieser Proof-of-Concept bildet den Grundstein für eine neue Klasse von kovalenten Lektininhibitoren, die potenziell als glykomimetische Therapeutika eingesetzt werden könnten. Insgesamt stellt diese Arbeit die erfolgreiche Etablierung von Methoden zur sequenz definierten Einführung von Katecholen in synthetische Makromoleküle vor, deren Bedeutung durch zwei verschiedene Anwendungen, die Synthese von Mfp-imitierenden Strukturen und glykomimetischen Strukturen, gezeigt wurde. Für beide Anwendungen wurde festgestellt, dass die Position und Präsentation von Katechol eine wesentliche Rolle für die endgültigen Eigenschaften spielt. Dies bildet die Grundlage für die weitere Erforschung des Potentials von Katecholen in diesen Bereichen, zeigt aber auch allgemein die Bedeutung der Sequenzkontrolle in biomimetischen Polymeren.Catechol moieties are mostly known for their important role in the unique ability of marine mussels to strongly stick to different surfaces in water and in presence of high salt concentrations. For this, mussels secrete a byssal thread that is made of different proteins that undergo surface contact, the so called mussel foot proteins (Mfps). These proteins consist of a high amount of the post translational modified amino acid L-DOPA, which presents a catechol moiety as side chain and is made responsible for their extraordinary adhesive properties. Catechols are not only interesting for their unique wet adhesive potential. Their chemical properties - the slow oxidation in basic conditions and subsequent reaction with nucleophiles like amines or thiols, also make them potential reactive components for use in eg. irreversible binding glycomimetic ligands. In nature, these biological macromolecules like proteins or glycoligands are synthesized with high control over sequence and positioning of functional side chains or interacting moieties. Therefore, this work now introduces catechol moieties into a new class of biomimetic macromolecules, the so-called precision macromolecules. The working group of Prof. Hartmann recently developed a synthesis towards precision macromolecules, the solid phase polymer synthesis (SPPoS) for sequence-defined oligo(amidoamine)s. This synthesis is based on the Merrifield peptide synthesis and uses tailor made building blocks that present a free acid and an Fmoc protected amine, as well as a functional side chain. This thesis focused on developing new protocols on the basis of SPPoS to introduce catechol moieties into sequence defined oligo(amidoamine)s and to synthesize biomimetic structures that investigate catechol binding to both, inorganic surfaces as well as proteins. In the first part of this thesis, a new synthetic strategy was developed giving access to building blocks in a faster and more efficient way. By introducing a one-pot reaction for selective Fmoc and functional side chain introduction, a prior occurring rearrangement is bypassed, three synthetic steps could be removed and the yield was drastically increased. Using this improved synthesis, two new building blocks were synthesized: the methyl ether protected, catechol presenting building block CDS (Catechol-Diethylenetriamine-Succinic acid) and the trityl protected amine building block TrDS (Trityl-Diethylenetriamine-Succinic acid). For the CDS building block, a selective cleavage of the methyl ether in presence of backbone aliphatic ether was developed by using trifluoromethanesulfonic acid and thioanisol for deprotection. With the building block TrDS, the synthesis of tertiary amine and primary amide structures was established by on resin deprotection of trityl and subsequent amide coupling with the desired functionality. Applying the developed methods, two classes of catechol-functionalized precision macromolecules were synthesized. First, precision macromolecules were synthesized inspired by the adhesive properties of mussels combining catechols and cationic moieties. Although a third moiety is usually found in Mfps with surface contact, the primary amide side chain of asparagine, its influence on adhesive strength has not been investigated before and now was included in this study for the first time. Besides that, the influence of sequence was yet not considered in synthetic systems and was now realized for catechol-functionalized precision macromolecules. In order to investigate the effects of precision macromolecule composition and monomer sequence on the adhesive properties, in collaboration with Alexander Strzelczyk and Jun. Prof. Dr. Stephan Schmidt, all precision macromolecules were attached to so-called soft colloidal probes (PEG microgels) and evaluated for their adhesion against glass surfaces. It was found that the combination of catechol with either of the two other functional groups led to a synergistic effect and an increase of adhesion energy higher than the sum of its individual parts. For the tertiary amine this is already known and is explained with the potential of amines to break up the hydration layer of the surface to increase accessibility for the catechol. But for the first time, this work showed the significant contribution of the primary amide towards wet adhesion and its synergy with catechols. Furthermore, a strong influence of sequence and spacing of functional group presentation was shown. Both, decreasing the distance between catechol and tertiary amine and presenting the catechol in closer proximity to the surface in comparison to the primary amide led to a drastic increase of adhesion and loss of pH dependence. As a next step, this new knowledge could pave the way towards optimized biomimetic adhesives for eg. medical glues, as it shows optimal functional group composition and presentation as a blueprint for new polymers. For a second class of catechol-functionalized sequence-defined oligo(amidoamine)s, catechols were introduced into precision glycomacromolecules to investigate their potential as reactive ligands. Glycomacromolecules are known to specifically bind bacterial adhesins and thereby block their adhesion, usually the first step of the infection process. However, this binding is highly reversible. In order to improve inhibitor effectivity, this could be combined with an additional covalent bond formation as was explored in this thesis by the introduction of catechol moieties. Together with Ricarda Steffens during her master thesis, the catechol moiety of dihydrocaffeic acid was acetonide protected and coupled to glycomacromolecules as assembled by previously established protocols of the Hartmann lab. Using turbidity and precipitation assays, it was shown, that combining catechols with the binding carbohydrate mannose improved the affinity towards ConA. The structures were also used in an adhesion inhibiton assay with live Escherichia coli (E. coli), testing the relative inhibitory potential (RIP) for E. coli adhesion towards a mannan surface. For an incubation time of one hour, similar RIP values to prior tested structures were found, but increasing the incubation time to 24 hours led to an effective inhibition of bacterial adhesion, hinting towards an oxidation of catechol moieties and covalent binding over time. This covalent binding was also proven towards ConA by measuring MALDI-TOF and SDS-PAGE which showed additional mass peaks corresponding to ConA subunit and ligand. Here, the structure with one catechol on each side of the carbohydrate moieties acted as a staple to effectively block the binding site of ConA, proving the importance of catechol presentation. Importantly, in all assays no interaction was found for the catechol containing galactose oligomers, showing that the specificity of the carbohydrate unit is remained. This proof of concept builds the cornerstone of a new class of covalent lectin inhbitors that potentially could be used as glycomimetic therapeutics. Overall, this work presents the successful establishment of methods for the sequence-defined introduction of catechols into synthetic macromolecules which significance was shown via two different applications, the synthesis of Mfp mimicking structures and glycomimetic structures. For both these applications, it was found that the position and presentation of catechol plays an integral role for final properties. This lays the foundation to further explore the potential of catechols in these fields, but also shows in general the importance of sequence-control in biomimetic polymers. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Organische Chemie und Makromolekulare Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.03.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.03.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.10.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 20.01.2021 |
