Dokument: Silencing and counter-silencing of the Lsr2-like protein CgpS in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Silencing and counter-silencing of the Lsr2-like protein CgpS in Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Silencing und Counter-Silencing des Lsr2-ähnlichen Proteins CgpS in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55633
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210305-110924-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M. Sc. Wiechert, Johanna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 57,74 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.03.2021 / geändert 04.03.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Frunzke, Julia [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Zurbriggen, Matias [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Horizontal gene transfer (HGT) is a major driving force of microbial evolution as it allows the rapid acquisition of new genetic traits. However, foreign DNA is likely to decrease the fitness of recipient cells by causing detrimental effects and therefore requires stringent control of gene expression. Hence, bacteria evolved a number of mechanisms allowing them to discriminate between self and non-self. Xenogeneic silencer (XS) proteins are nucleoid-associated proteins that preferentially bind to horizontally acquired DNA based on differences in nucleotide composition, in particular a higher AT content. XS proteins are widely distributed in bacteria and belong to one of the four classes comprising the H-NS-like XS, Rok, MvaT/U-like proteins, and Lsr2-like XS proteins. They play a predominant role in the acquisition of novel genetic material and oligomerization of XS proteins to higher-order nucleoprotein complexes tightly inhibits transcription. Binding of a transcription factor (TF) within a silenced region may interfere with the XS-DNA complex leading to counter-silencing and activation of gene expression. Consequently, XS and counter-silencing facilitate the integration of novel genetic material into host regulatory circuits enabling the appropriate expression in response to physiological and environmental stimuli. The aim of this thesis was to investigate the rules underlying silencing and counter-silencing of the medically and biotechnologically relevant Lsr2-like proteins conserved in actinobacteria by using CgpS from Corynebacterium glutamicum as a model. CgpS has previously been identified as an Lsr2-like XS, which is crucial for maintaining the lysogenic state of an AT-rich, cryptic prophage element. In this thesis, genome-wide bioinformatic analyses showed that CgpS preferentially binds to long and consecutive AT-rich stretches and that CgpS targets typically feature a distinct drop in GC-profile close to the transcriptional start site (TSS). Furthermore, a sequence-specific binding motif containing multiple A/T steps was overrepresented in CgpS bound regions. The importance of the drop in GC-profile and the putative binding motif for CgpS silencing was verified by performing in vivo reporter studies with synthetic variants of native CgpS target promoters, demonstrating that both DNA features cooperatively support CgpS-mediated silencing. Following a synthetic counter-silencer approach, the operator sequence of the gluconate-responsive TF GntR was inserted within diverse CgpS silenced promoters at different positions. Binding of GntR led to disruptive counter-silencing at various CgpS target promoters demonstrating flexibility in promoter architecture of these horizontally acquired targets. Almost all binding site positions resulted in differential gene expression, but counter-silencing efficiency strongly depended on the binding site position. The most prominent effect was observed at the position of maximal CgpS binding close to the TSS. Counter-silencer constructs usually showed only low background activity. To verify their potential as expression systems for synthetic biology applications demanding stringent control of gene expression, activities were compared to established expression systems (Ptac and Ptet). It was demonstrated that counter-silencer constructs have a significantly reduced background activity while showing strong inducibility with temporal tunability. By combining all synthetic constructs showing differential gene expression, a gluconate-responsive synthetic promoter library was generated (28 activated and 16 repressed promoters). Finally, this overall principle of xenogeneic silencing and counter-silencing was harnessed for the design of a GntR-controlled synthetic toggle switch featuring robust and reversible output in response to gluconate availability. This regulatory circuit was successfully implemented as metabolic toggle in a C. glutamicum L-valine production strain and enabled the dynamic redirection of carbon flux between biomass and product formation. In conclusion, this thesis provides comprehensive insights into the CgpS target recognition mechanism during silencing and shows the first systematic analysis of mechanisms allowing counter-silencing of Lsr2-like XS proteins in actinobacteria. Furthermore, the potential of silencing and counter-silencing for synthetic and biotechnological applications was demonstrated. Der horizontale Gentransfer (HGT) stellt eine wichtige treibende Kraft der mikrobiellen Evolution dar, da er die schnelle Gewinnung neuer genetischer Merkmale ermöglicht. Fremd-DNA verringert jedoch aufgrund schädlicher Auswirkungen mit hoher Wahrscheinlichkeit die Fitness der Empfängerzellen und erfordert daher eine stringente Kontrolle der Genexpression. Daher entwickelten Bakterien eine Reihe von Mechanismen, die ihnen die Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst ermöglichen. Xenogene silencer (XS) Proteine sind Nukleoid-assoziierte Proteine, die auf Basis von Unterschieden in der Nukleotid-Zusammensetzung, insbesondere einem höheren AT-Gehalt, bevorzugt an horizontal erworbene DNA binden. XS-Proteine sind in Bakterien weit verbreitet und gehören zu einer von vier Klassen. Diese umfassen die H-NS- und MvaT/U-artigen XS, Rok und Lsr2-ähnliche XS-Proteine. XS spielen eine entscheidende Rolle bei dem Gewinn von neuem genetischen Material und durch Oligomerisierung zu Nukleoprotein-Komplexen höherer Ordnung inhibieren sie stark die Transkription. Die Bindung eines Transkriptionsfaktors (TF) innerhalb einer stillgelegten Region kann mit dem XS-DNA-Komplex interferieren. Dies führt zu einer Aufhebung des silencing und zur Aktivierung der Genexpression (counter-silencing). Demnach erleichtern XS und counter-silencing die Integration von neuem genetischen Material in das regulatorische Netzwerk des Wirts und ermöglichen dessen angemessene Expression in Reaktion auf physiologische und umgebungsbedingte Stimuli. Das Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der Regeln, die dem silencing und counter-silencing der medizinisch und biotechnologisch relevanten, in Aktinobakterien konservierten Lsr2-ähnlichen Proteinen zugrunde liegen, unter Verwendung von CgpS von Corynebacterium glutamicum als Modell. CgpS war zuvor als ein Lsr2-ähnliches XS-Protein identifiziert worden und ist für die Aufrechterhaltung des lysogenen Zustands eines AT-reichen, kryptischen Prophagen-Elements von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit zeigten genomweite bioinformatische Analysen, dass CgpS bevorzugt lange und konsekutive AT-reiche Sequenzen bindet und dass CgpS-Ziele typischerweise einen deutlichen Abfall des GC-Profils in der Nähe des Transkriptionsstarts (TSS) aufweisen. Zusätzlich war ein sequenzspezifisches DNA-Motiv mit mehreren A/T-Schritten in CgpS-gebundenen Regionen überrepräsentiert. Dessen Bedeutung und die des mutmaßlichen DNA-Bindungsmotivs für das CgpS-silencing wurde durch in vivo Reporterstudien mit synthetischen Varianten von nativen CgpS-Zielpromotoren verifiziert. Diese zeigten, dass beide DNA-Merkmale kooperativ zum CgpS-vermittelten silencing beitragen. In einem synthetischen counter-silencing Ansatz wurde die Operatorsequenz des Glukonat-abhängigen TF GntR in verschiedene CgpS-gebundene Promotoren an unterschiedlichen Positionen eingefügt. Die Bindung von GntR führte zu disruptivem counter-silencing von mehreren CgpS-Zielpromotoren, wodurch die Flexibilität in der Promotorenarchitektur dieser horizontal erworbenen Ziele demonstriert wurde. Fast alle Bindestellenpositionen führten zu einer differentiellen Genexpression, jedoch war die counter-silencing Effizienz stark von der Positionierung abhängig. Der auffälligste Effekt wurde an der Stelle der maximalen CgpS-Bindung in der Nähe des TSS beobachtet. Üblicherweise wiesen die counter-silencing-Konstrukte nur eine geringe Basalaktivität auf. Zur Verifizierung ihres Potenzials als Expressionssysteme für Anwendungen der Synthetischen Biologie, die eine stringente Kontrolle der Genexpression erfordern, wurden ihre Aktivitäten mit denen von etablierten Expressionssystemen (Ptac und Ptet) verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass counter-silencing-Konstrukte eine signifikant reduzierte Basalaktivität und gleichzeitig eine starke Induzierbarkeit mit zeitlicher Abstimmbarkeit aufweisen. Durch die Kombination aller synthetischen Konstrukte, die eine differentielle Genexpression zeigten, wurde eine Glukonat abhängige, synthetische Promotorbibliothek generiert (28 aktivierte und 16 reprimierte Promotoren). Die silencing und counter-silencing Prinzipien wurden schließlich für die Konstruktion eines synthetischen, GntR-gesteuerten genetischen Schalters genutzt, der robust und reversibel auf die Verfügbarkeit von Glukonat reagierte. Dieser Regelkreis wurde erfolgreich als metabolischer Schalter in einem C. glutamicum L-Valin Produktionsstamm implementiert, wo er die dynamische Umlenkung des Kohlenstoffflusses zwischen Biomasse- und Produktbildung ermöglichte. Zusammenfassend bietet diese Arbeit umfassende Einblicke in den CgpS-Zielerkennungsmechanismus während des silencing und zeigt die erste systematische Analyse von Mechanismen, die das counter-silencing von Lsr2-ähnlichen XS-Proteinen in Aktinobakterien ermöglichen. Darüber hinaus wurde das Potenzial von silencing und counter-silencing für synthetische und biotechnologische Anwendungen demonstriert.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	05.03.2021
Dateien geändert am:	05.03.2021
Promotionsantrag am:	27.02.2020
Datum der Promotion:	15.07.2020