Dokument: Unconventional roles of the GABARAP subfamily of human ATG8 proteins in trafficking and degradation of cell surface proteins

Titel:	Unconventional roles of the GABARAP subfamily of human ATG8 proteins in trafficking and degradation of cell surface proteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55495
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210219-104153-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dobner, Jochen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] OpenOffice Textdokument, Adobe PDF, Windows AVI Video [Details] 71,11 MB in 4 Dateien [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.02.2021 / geändert 13.02.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Bode, Johannes [Gutachter] Prof. Dr. Jörg Tatzelt [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	While in yeast a single autophagy-related 8 (Atg8) gene is expressed, two subfamilies have evolved from it in humans. The microtubule-associated 1 protein light chain 3 (MAP1LC3 or short LC3) subfamily consists of LC3A, LC3B, LC3B2 and LC3C, while the γ-aminobutyric acid type A receptor-associated protein (GABARAP) subfamily consists of GABARAP, GABARAP-like 1 (GABARAPL1) and GABARAP-like 2 (GABARAPL2). Members of both subfamilies exhibit an ubiquitin-like fold and thus high cross-family structural similarity. Among the diverse functions described for human ATG8 proteins, their involvement during autophagy is best characterized. Autophagy designates an evolutionarily conserved degradation process activated by nutrient deficiency, during which a cell encloses components of the cytoplasm within a double membrane. The resulting vesicles contain cytoplasmic cargo and are termed autophagosomes. Autophagosomes mature by fusion with lysosomes into autolysosomes. The cytoplasmic cargo is degraded within the acidic environment of this organelle, whereupon the resulting building blocks are used to ensure cell survival. GABARAP subfamily proteins have been described to be involved in every step of autophagy initiation as well as autophagosome biogenesis, transport and their fusion with lysosomes. Much progress has been made in deciphering these autophagy-related functions, particularly for GABARAP. Originally, however, GABARAP and its paralogs were recognized for their involvement in vesicular transport processes and the clustering of cell surface receptors. Due to the high structural redundancy, the exact involvement of the whole GABARAP subfamily and its individual members is not yet entirely clear for any of these processes. The aim of this work was therefore to identify unique and non-redundant functions of GABARAP subfamily proteins during autophagy-independent processes. To achieve this, CRISPR/Cas9-mediated genome editing was applied to generate gene knockouts (KOs) of individual GABARAP subfamily members and combinations thereof, up to deletion of the complete subfamily, in two different cell lines. The resulting cell lines contributed to a publication describing an institute’s own novel antibody specific for GABARAP during immunofluorescence (IF) measurements. Here, it could be shown that validation of antibodies should be performed for every application individually, as commercially available antibodies, which were readily validated for immunoblotting, failed to specifically detect GABARAP during IF. More importantly for the scope of the presented PhD thesis, the panel of KO cell lines generated laid the groundwork for subsequent analyses investigating biological functions of GABARAP subfamily proteins during vesicular trafficking of cell surface proteins. Because GABARAP subfamily proteins had been described to be of importance for the surface abundance of individual surface receptors, the question of whether they had a more general impact on cell surface protein trafficking arose. To address this, plasma membrane (PM) located surface-exposed proteins of triple KO (TKO) cells lacking the whole GABARAP subfamily and wildtype (WT) cells were labelled by biotinylation and extracted. The resulting surface proteomes (surfaceomes) of TKO and WT cells were identified and quantified by mass-spectrometry in cooperation with the Molecular Proteomics Laboratory of the Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Comparative data analysis revealed a subset of cell surface proteins with altered PM abundance between TKO and WT cells. These included already known GABARAP interactors such as transferrin receptor and novel hits such as e.g. a subgroup of transport and channel proteins. In a joint project, TKO cells were further shown to display impaired anterograde vesicular trafficking of fluorescently labelled lipids and a dispersed Golgi apparatus network morphology. Both observations likely contribute to the changes in surfaceome composition observed for TKO cells compared to WT controls. Taken together, this work provides a framework to identify and characterize novel targets of GABARAP subfamily-dependent vesicular trafficking and highlights the necessity to consider autophagy-independent functions during analysis of any of the functions of the GABARAP subfamily. Since the unbiased surfaceome approach inherently cannot provide profound mechanistic insights, a model system to study the impact of GABARAP subfamily proteins on endosomal trafficking and degradation of receptor proteins in more detail had to be identified. Finally, the epidermal growth factor (EGF) receptor (EGFR) was identified to meet the criteria of such an optimal model system, as it was already well studied and provided the necessary tools to investigate its intracellular trafficking, and some links to GABARAP proteins had already been established in the literature. By employing KO cell lines and combining molecular biological and biochemical techniques, a novel and unique role for GABARAP during EGFR trafficking and degradation was revealed. The mere absence of GABARAP, but not of any of the other GABARAP subfamily proteins, was shown to result in accelerated EGF-induced receptor degradation in two independent cell lines. This was accompanied by reduced signal transduction, EGF uptake over time and target gene expression. Furthermore, it could be shown that GABARAP and EGFR associate together during co-immunoprecipitation experiments. To investigate the relevance of GABARAP during EGFR trafficking in living cells, the coding sequence for a green fluorescent protein (GFP) was knocked in upstream of the GABARAP gene locus via CRISPR/Cas9-mediated genome editing. The resulting knock-in (KI) cell line expresses the sequence for a GFP-GABARAP fusion protein under control of endogenous regulatory elements at physiological expression levels. For the first time such a GFP-GABARAP KI cell line was employed in a joint project to show transient dynamic comigration of fluorescently labelled EGF and GFP-GABARAP in living cells. In summary, this work provides novel insights into autophagy-independent functions of the GABARAP subfamily and identified a unique function for GABARAP in mediating intracellular trafficking and degradation of the EGFR. Während in Hefe ein einziges autophagy related (Atg) 8 (Atg8) Gen exprimiert wird, haben sich daraus in Menschen zwei Unterfamilien entwickelt. Die microtubule associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3 oder kurz LC3 )Unterfamilie besteht aus LC3A, LC3B, LC3B2 und LC3C, während die γ-aminobutyric acid type A receptor associated protein (GABARAP )Unterfamilie aus GABARAP, GABARAP like 1 (GABARAPL1) und GABARAP like 2 (GABARAPL2) besteht. Mitglieder beider Unterfamilien weisen eine ubiquitinähnliche Tertiärstruktur auf und besitzen somit eine hohe interfamiliäre Strukturhomologie. Unter den vielfältigen Funktionen, die für humane ATG8-Proteine bereits beschrieben wurden, ist ihre Beteiligung an der Autophagie am besten charakterisiert. Autophagie bezeichnet einen evolutionär konservierten Abbauprozess, der durch Nährstoffmangel aktiviert wird und während dessen eine Zelle zytoplasmatische Bestandteile in einer Doppelmembran einschließt. Die resultierenden Vesikel werden als Autophagosomen bezeichnet. Diese maturieren durch Fusion mit Lysosomen zu Autophagolysosomen. Im sauren Milieu dieses Organells wird die eingeschlossene zytoplasmatische Fracht schließlich abgebaut. Die resultierenden recycelten Bausteine können anschließend genutzt werden, um das Zellüberleben sicherzustellen. Während jedes Schrittes der Autophagie, inklusive ihrer Initiierung, der Autophagosomen-Biogenese, deren Wachstum, Transport sowie ihrer Fusion mit Lysosomen ist eine Beteiligung von Proteinen der GABARAP-Unterfamilie beschrieben. Große Fortschritte wurden hinsichtlich der Entschlüsselung der autophagiebezogenen Funktionen, besonders in Bezug auf Proteine der GABARAP-Unterfamilie, erzielt. Ursprünglich wurden GABARAP und seine Paraloge jedoch im Zusammenhang mit ihrer Beteiligung an vesikulären Transportprozessen und der Gruppierung von Zelloberflächenrezeptoren beschrieben. Aufgrund ihrer hohen strukturellen Ähnlichkeit ist die exakte Beteiligung der gesamten GABARAP-Unterfamilie und ihrer individuellen Mitglieder während dieser Prozesse noch nicht vollständig geklärt. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Identifizierung einzigartiger Funktionen von Proteinen der GABARAP-Unterfamilie während autophagieunabhängiger Transportprozesse. Um dies untersuchen zu können, wurde die CRISPR/Cas9-Methode zur Genomeditierung angewendet, um Knock outs (KOs) individueller GABARAP Gene sowie Zweifach-Kombinationen derer bis hin zur Ausschaltung der gesamten Unterfamilie in zwei verschiedenen Zelltypen zu erzeugen. Auf diese Weise konnten Zelllinien generiert werden, die eine Defizienz für jedes Unterfamilienprotein einzeln, Kombinationen von zweien oder eine komplette Defizienz für die gesamte Unterfamilie aufweisen. Diese Zelllinien leisteten einen Beitrag zu einer Publikation, die einen institutseigenen GABARAP-spezifischen Antikörper für Immunfluoreszenz (IF )Messungen beschreibt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Validierung von Antikörpern für jede Anwendung individuell durchgeführt werden sollte, da kommerziell erhältliche Antikörper, die zwar für die Anwendung bei Immunoblotting-Experimenten validiert wurden, nicht in der Lage waren GABARAP während IF-Experimenten spezifisch zu detektieren. Von größerer Wichtigkeit in Bezug auf die vorliegende Dissertation war jedoch, dass die generierten KO-Zelllinien den Grundstein für die nachfolgenden Untersuchungen der biologischen Funktionen der GABARAP-Unterfamilie während des vesikulären Transports von Zelloberflächenproteinen bildeten. Da bereits beschrieben wurde, dass einzelne Proteine der GABARAP-Unterfamilie eine Rolle bei der Oberflächenlokalisierung bestimmter Oberflächenrezeptoren spielen, stellte sich die Frage nach einem generelleren Einfluss auf deren Transport. Um dies zu analysieren, wurden Plasmamembran (PM )ständige oberflächenexponierte Proteine von triple KO (dreifach KO, TKO )Zellen, denen die ganze GABARAP-Unterfamilie fehlt, und Wildtyp (WT )Zellen mit Biotin markiert und extrahiert. Die resultierenden Oberflächen-Proteome von TKO und WT Zellen wurden in Zusammenarbeit mit dem Molecular Proteomics Laboratory der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf mittels Massenspektrometrie identifiziert und quantifiziert. Vergleichende Datenanalysen offenbarten eine Untergruppe an Proteinen mit veränderter Oberflächenabundanz zwischen TKO und WT Zellen. Diese beinhalteten bereits bekannte GABARAP-Interaktoren, wie etwa den Transferrin-Rezeptor, aber auch potentiell neuartige Zielproteine, wie etwa eine Untergruppe bestehend aus Transport- und Kanalproteinen. In einem gemeinsamen Projekt konnte zusätzlich gezeigt werden, dass TKO-Zellen einen beeinträchtigten vesikulären Transport von fluoreszenzmarkierten Lipiden und ein fragmentiertes Golgi-Netzwerk aufweisen. Beide Beobachtungen tragen wahrscheinlich zu den beobachteten Unterschieden der Zusammensetzung der Oberflächen-Proteome zwischen TKO und WT Zellen bei. Zusammenfassend bildet diese Arbeit einen Rahmen zur Identifizierung und Charakterisierung neuer Zielproteine, deren vesikulärer Transport von noch näher zu definierenden GABARAP/L1/L2-Funktionen abhängt. Außerdem zeigt sie die Notwendigkeit auf, autophagieabhängige und unabhängige Auswirkungen der GABARAP-Unterfamilie während der Analyse ihrer Funktionen zu berücksichtigen. Weil der unvoreingenommene Ansatz des vergleichenden Oberflächen-Proteoms intrinsisch keine profunden mechanistischen Einblicke zulässt, musste schließlich ein Modellsystem gefunden werden, das die Analyse des Einflusses der GABARAP-Unterfamilienproteine auf den endosomalen Transport und die Degradierung von Rezeptorproteinen ermöglicht. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF )Rezeptor (EGFR) wurde schlussendlich identifiziert, alle nötigen Kriterien eines solchen Modellsystems zu erfüllen, da er bereits gut untersucht und die notwendigen Werkzeuge zur Untersuchung seines intrazellulären Transports dadurch unmittelbar vorhanden waren. Zudem waren in der Literatur bereits Verknüpfungen zu GABARAP-Proteinen bekannt. Durch die Anwendung von KO-Zelllinien und der Kombination von molekularbiologischen und biochemischen Techniken wurde eine neue und einzigartige Rolle von GABARAP während des intrazellulären Transports des EGFR sowie dessen Degradierung und Recycling entdeckt. Die bloße Abwesenheit von GABARAP, nicht aber eines der beiden anderen Paraloge, führte zu einer beschleunigten EGF-induzierten EGFR-Degradierung in zwei unabhängigen Zelllinien. Zudem waren die Signaltransduktion, die EGF-Aufnahme über die Zeit und die Genexpression von Zielgenen verringert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass GABARAP und EGFR während Co-Immunopräzipitationsexperimenten miteinander assoziieren. Um die Relevanz von GABARAP für den EGFR-Transport in lebenden Zellen zu untersuchen, wurde die codierende Sequenz für ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) mittels der CRISPR/Cas9-Methode zur Genomeditierung vor den GABARAP Genlokus eingebracht. Die resultierende knock-in (KI )Zelllinie (GFP-GABARAP KI) exprimiert die Sequenz für ein GFP-GABARAP-Fusionsprotein unter der Kontrolle der endogenen regulatorischen Elemente und somit auf physiologischem Niveau. Erstmals wurden solche GFP-GABARAP KI-Zellen benutzt, um in einem Kooperationsprojekt zu zeigen, dass fluoreszenzmarkiertes EGF und GFP-GABARAP in lebenden Zellen transient dynamisch komigrieren. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass die vorliegende Promotionsarbeit neuartige Einblicke in die autophagieunabhängigen Funktionen der GABARAP-Unterfamilie bietet. Zudem wurde eine einzigartige Funktion für GABARAP während des intrazellulären Transports und der Degradierung des EGFR identifiziert.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	19.02.2021
Dateien geändert am:	19.02.2021
Promotionsantrag am:	24.09.2020
Datum der Promotion:	28.01.2021