Dokument: In vitro characterization of the human ABC transporter MDR3/ABCB4
| Titel: | In vitro characterization of the human ABC transporter MDR3/ABCB4 | |||||||
| Weiterer Titel: | In vitro Charakterisierung des humanen ABC Transporters MDR3/ABCB4 | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55409 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210210-112040-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Prescher, Martin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Keitel-Anselmino, Verena [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | ABCB4, MDR3, Floppase | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Die kanalikuläre Membran der Hepatozyten der Leber stellt ein Beispiel für eine transversale Lipidasymmetry in einer biologischen Membran, die auf Umweltreize reagieren kann, dar. Hier wird durch einen erhöhten Phosphatidylcholin (PC)-Lipid Anteil im äußeren Blatt die Membran vor der harschen Detergenz-Aktivität von Gallensalzen geschützt. Dabei sorgt der ABC-Transporter ABCB4 für die PC-Lipid Anreicherung im äußeren Blatt durch den transversalen flopp zytosolischer PC-Lipide. Es wurde gezeigt, dass eine ABCB4-Defizienz sogar zu mehreren klinisch relevanten Krankheitsbildern führen kann. Ein übergeordnetes Symptom ist die Verringerung oder das komplette Nichtvorhandensein von PC-Lipiden in der Galle. Ohne PC-Lipide liegen Cholesterin und Gallensalze nicht mehr gelöst vor, wodurch sich Gallensteine formieren und Cholestasen entstehen können. Ungeklärt ist aber noch, welche Eigenschaft von ABCB4 diesen Schutz vor harschen Gallensalzen bietet, welche Attribute ein Substrat aufweisen muss, um mit ABCB4 zu interagieren und wie ABCB4 mechanistisch funktioniert. Dazu konnten in dieser Arbeit zwei Schlüsselentdeckungen gemacht werden.
Erstens sorgt ABCB4 für eine asymmetrische Membran mit einem 3 zu 1 Überschuss an PC im äußeren Blatt der kanalikulären Membran. Dieser PC-Anteil umfasst aber diverse PC Lipidvarianten, mehr als nur jene, die in die Galle sekretiert werden. Dadurch bleibt die Membran auch noch intakt, sobald einige PC-Lipide durch Gallensalze solubilisiert wurden. Ein Substrat von ABCB4 muss dabei vier Eigenschaften aufweisen, um produktiv mit ABCB4 zu interagieren. Eine Phosphatidylcholin Kopfgruppe muss an ein Glyceringerüst gebunden sein, an dem wiederrum zwei Fettsäuren verestert sind, die eine Mindestlänge von 12 Kohlenstoffen besitzen und dadurch für eine ausreichend amphipathische Eigenschaft sorgen. Als ideal erwies sich 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) ein 18-C langes PC-Lipid mit je einer einfach ungesättigten Fettsäure. Zweitens scheint eine sekundäre Eigenschaft in ABCB4 zu existieren, die in der Literatur bereits für Kontroversen gesorgt hat. Diese sekundäre Eigenschaft bezieht sich auf den hohen Verwandtschaftsgrad zwischen dem prototypischen Multidrogen Exporter ABCB1 und der PC-Floppase ABCB4. Einige Substrate und Inhibitoren des ABCB1 wie Vinblastin oder Digitoxin scheinen auch mit ABCB4 zu interagieren, wodurch ein geteiltes Interaktions-Grundprinzip zwischen ABCB1 und ABCB4 zugrunde liegen könnte. Unterschiede zwischen diesen beiden Proteinen häufen sich unter anderem in der Transmembrane Helix 1 (TMH1). Hier sind hydrophobe Aminosäuren aus ABCB1 durch hydrophile Aminosäuren in ABCB4 ersetzt. Drei konkrete Mutationen (Q52L, S58V, S69A) führten in einem mutierten ABCB4 Protein, in dem alle drei hydrophoben Aminosäuren Varianten des ABCB1 eingefügt wurden, zu einem Verlust der Stimulierbarkeit der ATPase Aktivität durch PC-Lipide. Bemerkenswert war, dass die Charakteristika der ABCB1 Modulatoren in ihrer Wirkung auf die ATPase Aktivität von ABCB4 nicht verändert wurden. Dies spricht dafür, dass das Protein zwar noch intakt ist, TMH1 aber nicht mehr mit den PC-Lipiden interagieren kann. Dies wurde durch einen Transportassay bestätigt, in dem PC-Lipide, die mit einem Fluorophor markiert waren, durch die ABCB4 Mutante nicht mehr transportiert wurden. Weitere Einblicke in einen möglichen Transportmechanismus von ABCB4 lieferten molekular dynamische Simulationen. Hier erschien ein Transportprinzip naheliegend, bei dem die hydrophobe Acylkette eines PC-Lipids nicht in den Proteinkern eindringen muss. Es ist ausreichend, dass die hydrophile Kopfgruppe, durch TMH1 von ABCB4 abgeschirmt wird, während die hydrophobe Acylkette in der Membran eingebettet bleibt. Dies führte dazu, dass das PC-Lipid lediglich an der membranzugewandten Seite des Proteins entlangwandert, ohne dass ein thermodynamischer Nachteil entsteht, der „bezahlt“ werden müsste, um ein amphipathisches Molekül über eine hydrophile Bindetasche zu transportieren.The canalicular membrane of hepatocytes of the liver is an example of transverse lipid asymmetry in a biological membrane that can respond to environmental changes. Here, an increased phosphatidylcholine (PC)-lipid content in the outer leaflet protects the membrane from the harsh detergent activity of bile salts. The ABC transporter ABCB4 is responsible for PC-lipid accumulation in the outer leaflet through the transverse flop of cytosolic PC-lipids. It has been shown that an ABCB4 deficiency can even lead to several clinically relevant diseases. A superordinate symptom is the reduction or complete absence of PC-lipids in bile. Without PC-lipids, cholesterol and bile salts are no longer soluble, which can lead to the formation of gallstones and cholestasis. However, it is still unclear, which property of ABCB4 provides this protection against harsh bile salts, what attributes a substrate must have in order to interact with ABCB4, and how ABCB4 functions mechanistically. Two key discoveries were made in this thesis. First, ABCB4 ensures an asymmetric membrane with a 3 to 1 excess of PC in the outer leaflet of the canalicular membrane. However, this PC fraction includes several PC-lipid variants, more than just those that end up in bile. Thus, the membrane remains intact even after some PC-lipids have been solubilized by bile salts. A substrate of ABCB4 must have four properties to interact productively with ABCB4. A phosphatidylcholine head group must be bound to a glycerol core, on which two fatty acids are esterified, with a minimum length of 12 carbon units. This is needed to provide sufficient amphipathic properties. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), an 18-C long PC-lipid with one monounsaturated fatty acid each, proved to be ideal. Secondly, there seems to be a secondary property of ABCB4 that has already caused controversy in the literature. This secondary property refers to the high degree of sequence identity between the prototypical multidrug exporter ABCB1 and the PC-floppase ABCB4. Some substrates and inhibitors of ABCB1 such as vinblastine or digitoxin also seem to interact with ABCB4, which could lead to a common principle of interaction between ABCB1 and ABCB4. Differences between these two proteins accumulate in transmembrane helix 1 (TMH1). Here, hydrophobic amino acids from ABCB1 are changed to hydrophilic amino acids in ABCB4. Three specific mutations (Q52L, S58V, S69A) led to a breakdown of the stimulation of ATPase activity by PC-lipids in a mutant ABCB4 protein, in which all three amino acids of ABCB1 were inserted. Remarkably, the characteristics of modulators were not changed with respect to ATPase activity of ABCB4. This indicates that the protein is still intact, but TMH1 can no longer interact with PC-lipids. A transport assay confirmed that PC-lipids labelled with a fluorophore were no longer transported by this ABCB4 mutant. Further insights into a possible transport mechanism of ABCB4 were provided by molecular dynamics simulations. A transport principle seemed to be favoured, in which the hydrophobic tail of a PC-lipid does not have to penetrate the protein’s interior. It was sufficient that the hydrophilic head group of a PC-lipid was shielded by the TMH1 of ABCB4, while the hydrophobic tail is still embedded in the membrane. As a result, the PC-lipid only migrates along the membrane-facing side of the protein without any thermodynamic disadvantage that would have to be paid to force an amphipathic molecule into a hydrophilic binding pocket. | |||||||
| Quelle: | Siehe Dissertation und entsprechende Literaturverzeichnisse | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Bezug: | Arbeit entstanden im zeitlichen Rahmen vom 15.06.2016-19.11.2021, Tag der mündlichen Verteidigung 3.2.2021 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.02.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.02.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.11.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 03.02.2021 |
