Dokument: Regulation of Lysosomal Chloride and Proton Concentrations in Mammalian Cells

Titel:	Regulation of Lysosomal Chloride and Proton Concentrations in Mammalian Cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55377
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210210-092658-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M. Sc. Jansen-Grabowski, Andrea [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 99,89 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.02.2021 / geändert 02.02.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Fahlke, Christoph [Gutachter] Prof. Dr. Christine R. Rose [Gutachter]
Stichwörter:	Lysosome, FLIM, chloride, MEQ, SPQ
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Lysosomen sind Zellorganellen, die eine wichtige Rolle beim Energiemetabolismus, der Antigenprozessierung und der Verdauung von Makromolekülen durch hydrolytische Enzyme spielen, und Veränderungen der lysosomalen Funktion werden mit schwerwiegenden Krankheiten in Verbindung gebracht. Wichtige Funktionen von Lysosomen sind abhängig von einer korrekten Ionen-Homöostase. Unser bisheriges Wissen über die Zusammensetzung und Regulation lysosomaler Ionen ist unzureichend. Das sehr saure Lumen erschwert den Gebrauch von genetischen Biosensoren für die Messung von Ionenkonzentrationen im Lysosom. In dieser Arbeit wird erstmals eine Methode demonstriert, mit der die beiden quinolinium-basierten chloridsensitiven Fluoreszenzfarbstoffe SPQ (6-Methoxy-N-(3- Sulfopropyl)Quinolinium) und MEQ (6-Methoxy-N-Ethylquinolinium Iodid) für die Messung der lysosomalen Chloridkonzentration ([Cl-]) mittels Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie (FLIM) verwendet werden können. SPQ und MEQ werden über Kollisions- Fluoreszenzauslöschung durch Chlorid gequencht und haben daher Fluoreszenzlebenszeiten, welche von der umgebenden Chloridkonzentration abhängen und zudem unabhängig von der Konzentration des Fluorophors und von Instrumenteneigenschaften sind, weshalb sich diese Messmethode perfekt für die Messung absoluter Konzentrationen eignet. SPQ ist membranimpermeabel und gelangt über Endozytose in die Lysosomen. Die reduzierte Form von MEQ, diH-MEQ, ist dagegen membranpermeabel und gelangt über Diffusion in die Zelle und die Lysosomen, wo es dann rasch zu MEQ reoxidiert [1]. MEQ ermöglicht daher das simultane Messen der lysosomalen und zytosolischen [Cl-] nach Vergrößerung der Lysosomen durch den PIKfyve-Blocker YM-201636. Unter physiologischen Bedingungen weisen die Lysosomen von HEK293T Zellen eine sehr hohe [Cl-] von ~150 mM auf, während die zytosolische [Cl-] etwa 56 mM beträgt. Um die Transportmechanismen zu untersuchen, welche für die lysosomale Chloridakkumulation sorgen, und um die Auswirkungen von Veränderungen in der lysosomalen [Cl-] zu verstehen, haben wir FLIM mit ratiometrischen pH-Messungen kombiniert, sowie mit der Überexpression, dem Knock-down und dem pharmakologischen Blockieren verschiedener Ionenkanäle und -transporter. Die Ergebnisse zeigen eine Korrelation zwischen der lysosomalen [Cl-] und dem pH. Des Weiteren deuten sie darauf hin, dass lysosomales Chlorid in einem sekundäraktiven Prozess, angetrieben von der vesikulären ATPase, akkumuliert wird. Die Chloridakkumulation ist elektrogen und wird über Änderungen des Membranpotentials modifiziert. Verschiedene Transporter, die möglicherweise bei der Akkumulation des lysosomalen Chlorid eine Rolle spielen, wurden getestet. Dabei wurde festgestellt, dass der Chlorid-Protonen-Antiporter ClC-7 Chlorid nicht akkumuliert, sondern heraustransportiert und dabei Protonen in das Lysosom bewegt. Lysosomes are cell organelles with important roles in energy metabolism, antigen processing, and digestion of macromolecules via hydrolytic enzymes, and changes in lysosomal function are associated with severe human diseases. Key lysosomal functions depend on proper ion homeostasis. Hitherto, our knowledge about the ion composition and regulation in lysosomes is insufficient. Lysosomes exhibit a very acidic pH, which impedes the use of genetically encoded biosensors for measuring ion concentrations in these organelles. In this work, it is demonstrated for the first time that the two quinolinium-based chloride-sensitive fluorescent dyes, SPQ (6-methoxy-N-(3-sulfopropyl)quinolinium) and MEQ (6-methoxy-N-ethylquinolinium iodide), can be used to measure lysosomal chloride concentrations ([Cl-]) via fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). SPQ and MEQ are collisionally quenched by chloride and exhibit chloride dependent fluorescence lifetimes, which are independent of fluorophore concentrations and instrumental properties and therefore perfectly suited as a readout to determine absolute concentrations. SPQ is membrane-impermeant and loaded into lysosomes via the endocytic pathway. A reduced form of MEQ, diH-MEQ, is membrane permeable and can be loaded into the cells and lysosomes via diffusion, where it is trapped after rapid reoxidization to the cell-impermeant MEQ [1]. MEQ thus permits simultaneous measurements of lysosomal and cytosolic chloride concentrations, after enlargement of the lysosomes via the PIKfyve inhibitor YM-201636. Under physiological conditions, lysosomes of HEK293T cells exhibit very high [Cl-] of ~150 mM, while the cytosolic [Cl-] is ~56 mM. To study transport processes that are responsible for lysosomal chloride accumulation and to understand the effects of changes in lysosomal [Cl-], FLIM was combined with ratiometric lysosomal pH measurements and overexpression, knock-down, or pharmacological blocking of various ion channels and transporters in HEK293T cells. Results from this work show a correlation between lysosomal [Cl-] and pH and that chloride facilitates lysosomal acidification. Furthermore, it is shown that lysosomes accumulate chloride in a secondary active process, driven by the vesicular v-type ATPases. Chloride accumulation is electrogenic and directly modified by changes in the membrane potential. Several candidate transporters were tested and could be ruled out. Results indicate that the chloride proton antiporter ClC-7 does not accumulate chloride in the lysosome but rather transports chloride out of the lysosome, thereby driving proton inward movement.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	10.02.2021
Dateien geändert am:	10.02.2021
Promotionsantrag am:	23.07.2020
Datum der Promotion:	21.01.2021