Dokument: Strain and Tool Development for the Production of Industrially Relevant Compounds with Corynebacterium glutamicum

Titel:	Strain and Tool Development for the Production of Industrially Relevant Compounds with Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Stamm- und Werkzeugentwicklung für die Produktion industriell relevanter Verbindungen mit Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55252
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210203-110216-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kortmann, Maike [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 61,05 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.01.2021 / geändert 24.01.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Stichwörter:	Biotechnology, Microbiology, Strain Engineering, Biosensors, Expression System
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Corynebacterium glutamicum is one of the most important model organisms in white biotechnology for the industrial production of numerous amino acids, most notably L-glutamate and L-lysine, but also of other metabolites and proteins. In order to further expand possible applications of this organism for the conversion of renewable feedstocks into industrially relevant compounds, two different approaches of strain engineering of C. glutamicum were addressed in the present thesis. In the first part of this work, a new expression system based on a chromosomally encoded T7 RNA polymerase and a plasmid-based T7 promoter was established and characterized in C. glutamicum. For this purpose, the T7 RNA polymerase (gene 1) was integrated into the prophage-free strain C. glutamicum MB001 under the control of the IPTG-inducible lacUV5 promoter, resulting in strain MB001(DE3). In addition, the expression plasmids pMKEx1 and pMKEx2 were constructed into which a target gen can be cloned under control of the T7 promoter and, if necessary, can be fused to a polyhistidine-tag or a Strep-tag. The T7 expression system was evaluated with the reporter gene eyfp and compared to the well-established pEKEx2 system, which is based on the tac promotor. The basal expression of the T7 system was lower than that of the pEKEx2 system. The specific fluorescence of eYFP increased 450-fold after maximal induction of the T7 system with 250 µM IPTG and was 3.5-fold higher than the specific eYFP fluorescence obtained after maximal eyfp expression with the pEKEx2 system. Furthermore, it was shown that proteins such as pyruvate kinase or secretory GFP proteins can also be successfully produced in higher amounts with the T7 system than with the pEKEx2 system. In the second part of this work, a genetically encoded biosensor for the cytoplasmic lysine concentra-tion was used to screen for mutated variants of pyruvate carboxylase (PCx), which enabled an im-proved L-lysine production. PCx catalyzes the ATP-dependent carboxylation from pyruvate to oxalo-acetate and plays an important role as anaplerotic enzyme. It replenishes the tricarboxylic acid cycle during growth on sugars when intermediates have been removed from the cycle by branching meta-bolic pathways. This reaction is for example of great importance for L-lysine production and it has already been shown that overexpression of the pyc gene as well as the mutation P458S in PCx lead to an increased L-lysine yield in C. glutamicum. In order to find further advantageous mutations for lysine production, a plasmid-based library with mutated pyc variants was generated in this work using error-prone PCR. Out of this library, two PCx variants could be isolated with the help of the lysine biosensor pSenLys-Spec and FACS-based high-throughput screening, which showed an increased lysine formation compared to the strain with wild-type PCx. The variants PCxT343A, I1012S and PCxT132A enabled an increase of the lysine titer by 9% and 19%, respectively, after plasmid-based overexpres-sion of the respective genes in the strain DM1868Δpyc/pSenLys-Spec. When the mutations were introduced one by one into the genome of the lysine-producing strain DM1868, the variant PCxT132A produced 7% more lysine and PCxT343A 15% more lysine compared to strain DM1868 encoding wild-type PCx. In previous studies, PCx activity of C. glutamicum could only be measured with permeabilized cells. For a more detailed characterization, conditions were established that enabled the measurement of PCx activity in cell-free extracts and the isolation of the enzyme in active form. For purified PCx, Km values of 3.8 mM for pyruvate, 0.6 mM for ATP, and 13.3 mM for bicarbonate were determined. ADP and aspartate inhibited PCx activity with Ki values of 1.5 mM and 9.3 mM, respectively. Initial charac-terization of the variants PCxT132A and PCxT343A revealed that their activity was not inhibited up to as-partate concentrations of approx. 7.5 mM. The Ki values of 13.2 mM for PCxT132A and 10.8 mM for PCxT343A were higher than for wild-type PCx and provide an explanation for the increased lysine pro-duction obtained with these variants in C. glutamicum. Corynebacterium glutamicum ist einer der wichtigsten Modellorganismus in der Weißen Biotechnologie und wird zur industriellen Produktion zahlreicher Aminosäuren, insbesondere von L-Glutamat und L-Lysin, aber auch weiteren Metaboliten und Proteinen eingesetzt. Um die Einsatzmöglichkeiten dieses Organismus für die Umwandlung von nachwachsenden Rohstoffen in industriell relevante Verbindun-gen weiter auszubauen, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei verschiedene Ansätze des Strain Engineering von C. glutamicum behandelt. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein neues Expressionssystem basierend auf einer chromosomal co-dierten T7-RNA-Polymerase und einem Plasmid-basierten T7-Promoter in C. glutamicum etabliert und charakterisiert. Dafür wurde das T7 RNA-Polymerase-Gen (gene 1) unter Kontrolle des IPTG-induzierbaren lacUV5 Promotors in den Prophagen-freien Stamm C. glutamicum MB001 integriert, was im Stamm MB001(DE3) resultierte. Zusätzlich wurden die Expressionsplasmide pMKEx1 und pMKEx2 konstruiert, in die Zielgene unter Kontrolle des T7-Promoters kloniert und bei Bedarf mit ei-nem Polyhistidin-Tag oder einem Strep-Tag fusioniert werden können. Das T7-Expressionssystem wurde zunächst mit dem Reportergen eyfp im Vergleich zum pEKEx2-System getestet, welches auf dem tac Promoter basiert. Hierbei wurde eine niedrigere Basalexpression des T7 Systems im Ver-gleich zum etablierten pEKEx2-System festgestellt. Die spezifische Fluoreszenz von eYFP stieg nach maximaler Induktion des T7-Systems mit 250 µM IPTG um das 450-fache und war 3,5-fach höher als die spezifische eYFP-Fluoreszenz, die nach maximaler eyfp-Expression mit dem pEKEx2-System erhalten wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch Proteine wie die Pyruvat-Kinase oder sekretorische GFP-Proteine in höheren Mengen als mit dem pEKEx2-System produziert werden kön-nen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein genetisch kodierter Biosensor für die cytoplasmatische Lysin-Konzentration verwendet, um nach Enzym-Varianten der Pyruvat-Carboxylase (PCx) zu screenen, die eine verbesserte L-Lysin-Produktion ermöglichen. PCx katalysiert die ATP-abhängige Carboxylierung von Pyruvat zu Oxalacetat und spielt eine wichtige Rolle als anaplerotisches Enzym. Es füllt den Tri-carbonsäurezyklus während des Wachstums auf Zuckern wieder auf, wenn Zwischenprodukte durch abzweigende Stoffwechselwege aus dem Zyklus entfernt worden sind. Diese Reaktion ist z.B. für die L-Lysin-Produktion von großer Bedeutung und es konnte bereits gezeigt werden, dass eine Überex-pression des pyc-Gens sowie die Mutation P458S in PCx zu einer erhöhten L-Lysin-Ausbeute in C. glutamicum führen. Um weitere vorteilhafte Mutationen für die Lysin-Produktion zu finden, wurde in dieser Arbeit eine Plasmid-basierte Bibliothek mit mutierten pyc-Varianten mittels Error Prone-PCR generiert. Aus dieser konnten im Anschluss mit Hilfe des Lysin-Biosensors pSenLys-Spec und FACS-basiertem Hochdurchsatz-Screening zwei PCx-Varianten isoliert werden, die eine gesteigerte Lysin-Bildung im Vergleich zum Stamm mit der Wildtyp-PCx zeigten. Die Varianten PCxT343A, I1012S und PCxT132A ermöglichten eine Erhöhung des Lysin-Titers um 9% und 19% nach Plasmid-basierter Über-expression der entsprechenden Gene im Stamm DM1868Δpyc/pSenLys-Spec. Wurden die Mutatio-nen einzeln in das Genom des Lysin-Produzenten DM1868 eingebracht, konnte mit der Variante PCxT132A 7% mehr Lysin produziert werden, mit PCxT343A 15% mehr im Vergleich zum Stamm DM1868 mit Wildtyp-PCx. In früheren Studien konnte die PCx-Aktivität von C. glutamicum nur mit permeabilisierten Zellen ge-messen werden. Für eine detailliertere Charakterisierung wurden Bedingungen geschaffen, die die Messung der PCx-Aktivität in zellfreien Extrakten und die Isolierung des Enzyms in aktiver Form er-möglichten. Für die gereinigte PCx wurden so Km-Werte von 3,8 mM für Pyruvat, 0,6 mM für ATP und 13,3 mM für Bicarbonat bestimmt. ADP und Aspartat hemmten die PCx-Aktivität mit Ki-Werten von 1,5 mM bzw. 9,3 mM. Eine erste Charakterisierung der Varianten PCxT132A und PCxT343A ergab, dass ihre Aktivitäten bis zu einer Aspartat-Konzentration von ca. 7,5 mM nicht gehemmt waren. Die Ki Wer-te waren mit 13,2 mM für PCxT132A und 10,8 mM für PCxT343A entsprechend höher und liefern damit eine erste Erklärung für die erhöhte Lysin-Produktion, die mit diesen Varianten in C. glutamicum erzielt wurden. Für PCxI1012S konnten keine signifikanten Unterschiede der gemessenen kinetischen Parame-ter im Vergleich zu Wildtyp-PCx beobachtet werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	03.02.2021
Dateien geändert am:	03.02.2021
Promotionsantrag am:	09.06.2020
Datum der Promotion:	20.11.2020