Dokument: Functional and structural characterization of the RTX proteins MbxA from Moraxella bovis and FrpA from Kingella kingae

Titel:	Functional and structural characterization of the RTX proteins MbxA from Moraxella bovis and FrpA from Kingella kingae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55214
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210120-112540-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Erenburg, Isabelle [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 31,00 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.01.2021 / geändert 15.01.2021
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, Johannes [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Repeats in Toxins (RTX)-Proteine stellen eine umfassende Proteinfamilie dar, deren Proteine von vielen Gram-negativen Bakterien sekretiert werden und durch die Anwesenheit einer konservierten Ca2+-Bindedomäne definiert sind. Der Name der Proteinfamilie leitet sich von charakteristischen, sich wiederholenden Glycin-reichen Sequenzen ab, die Calcium-Ionen koordinieren und der Tatsache, dass es sich bei den ersten beschriebenen Vertretern um Poren-bildende Toxine handelte. RTX-Proteine sind allerdings nicht nur für die Pathogenität maßgeblich, sondern auch an der Interaktion der Bakterien mit ihrer Umwelt zum Beispiel im Rahmen der Adhäsion oder Biofilm-Bildung beteiligt. Die Sekretion verläuft über spezialisierte Typ I Sekretionssysteme (T1SS) in einem Ein-Schritt-Mechanismus über die innere und die äußere Membran Gram-negativer Bakterien. Hemolysin A (HlyA), ein Poren-bildendes Protein sekretiert von uropathogenen Escherichia coli (E. coli) war nicht nur das erste identifizierte RTX-Protein, sondern wird auch als Prototyp der RTX-Proteine und Typ I Sekretion betrachtet. Das Sekretionssystem besteht aus dem ATP-binding cassette (ABC)-Transporter Hemolysin B, dem Membranfusionsprotein Hemolysin D und dem äußeren Membranprotein TolC, welche im assemblierten Zustand beide Membranen von E. coli überspannen. Jenseits der Porenbildung bleibt die Aktivität von HlyA aber unklar, da bekannt ist, dass HlyA Wirtszellfunktionen auf unterschiedlichen Wegen manipulieren kann. In dieser Dissertation wurden bisher wenig charakterisierte oder putative RTX-Proteine basierend auf einem bioinformatischen Ansatz für eine strukturelle und funktionelle Charakterisierung ausgesucht. Zwei Kandidaten, FrpA aus dem Humanpathogen Kingella kingae und MbxA aus dem bovinen Pathogen Moraxella bovis, wurden über das HlyA T1SS sekretiert, wenn sie mit diesem in E. coli BL21(DE3) exprimiert wurden. Das zeigt, dass das HlyA Sekretionssystem als effiziente Plattform für die Produktion von heterologen RTX-Proteine genutzt werden kann. Darüber hinaus wurde MbxA mittels posttranslationaler Acylierung, katalysiert durch die co-exprimierte E. coli Acyltransferase Hemolysin C, heterolog aktiviert. Anschließend wurden Protokolle zur Reinigung von FrpA und MbxA entwickelt. Initiale Strukturuntersuchungen, unter anderem mittels Kleinwinkel-röntgenstreuung (SAXS) und Kryoelektronenmikroskopie, zeigten, dass HlyA, FrpA und MbxA eine flexible und längliche Konformation gemeinsam haben, welche potentiell ein Charakteristikum von RTX-Proteinen darstellt. Die SAXS-Analyse lieferte dreidimensionale ab initio Modelle von HlyA und FrpA. Massenspektrometrie und funktionelle Studien zeigten, dass MbxA ein Poren-bildendes Toxin ist, dessen zytotoxische Aktivität streng von der posttranslationalen Acylierung interner Lysinreste abhängt. Es wurde demonstriert, dass MbxA ein Spezies- und Zielzell-unabhängiges Protein ist. MbxA wirkt nicht nur hämolytisch sondern verursacht auch Membranläsionen in menschlichen Epithelzellen und T-Zellen. Die halb-maximale Zytotoxizität von MbxA gegenüber menschlichen Zellen wurde bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen gemessen. Des Weiteren wurde mithilfe von Live cell imaging gezeigt, dass die durch MbxA induzierte Permeabilisierung von Epithelzellen zu Umstrukturierungen der Zellmembran führt, die in der Bildung von charakteristischen Membranbläschen resultiert. Repeats in Toxins (RTX) proteins are a large family of proteins secreted by many Gram-negative bacteria and are defined by a conserved Ca2+ binding domain. The name of the protein family originates from a repetition of characteristic glycine-rich sequences that coordinate calcium ions and the fact that the first described members were pore-forming toxins. However, members of the RTX protein family not only mediate pathogenicity but are also involved in other aspects of interaction of bacteria with the environment such as adhesion or biofilm formation. Secretion occurs via dedicated type I secretion systems (T1SS) in a one-step mechanism across the inner and the outer membrane of the Gram-negative bacterium. Hemolysin A (HlyA), a pore-forming toxin secreted by uropathogenic Escherichia coli (E. coli) is not only the first identified RTX protein but also considered a prototype of RTX proteins and type I secretion. Its secretion system consists of the ATP-binding cassette (ABC) transporter hemolysin B, the membrane fusion protein hemolysin D and the outer membrane protein TolC, which when assembled span both membranes of E. coli. However, the activity of HlyA beyond pore formation remains elusive as it is known to manipulate host cells functions in various ways. In this thesis, poorly characterized or putative RTX proteins were selected on the basis of a bioinformatic approach for structural and functional characterization. Two candidates, FrpA from the human pathogen Kingella kingae and MbxA from the bovine pathogen Moraxella bovis, were secreted by the HlyA T1SS when expressed in E. coli BL21(DE3). This demonstrates that the HlyA system can serve as an efficient platform for the production of heterologous RTX proteins. Moreover, MbxA was heterologously activated through post-translational acylation, catalyzed by the co-expressed E. coli acyltransferase hemolysin C. Subsequently, purification protocols for FrpA and MbxA were developed. Initial structural investigations including small-angle X-ray scattering (SAXS) and cryogenic electron microscopy revealed that HlyA, FrpA and MbxA share a flexible and elongated conformation which is potentially a characteristic of RTX proteins. SAXS analysis yielded a three-dimensional ab initio model for HlyA and FrpA in solution. Mass spectrometry and functional studies confirmed that MbxA is a pore-forming toxin that strictly relies on post-translational acylation of internal lysine residues for cytotoxic activity. It was demonstrated that MbxA is a species- and cell type-unspecific protein. MbxA displayed not only hemolysis but was shown to induce membrane lesions in human epithelial cells and T cells. Half maximal cytotoxicity of MbxA against human cells was measured at low nanomolar concentrations. Furthermore, live cell imaging showed an immediate MbxA-induced permeabilization of epithelial cells that lead to rearrangements of the cell membrane resulting in characteristic membrane blebbing.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	20.01.2021
Dateien geändert am:	20.01.2021
Promotionsantrag am:	27.10.2020
Datum der Promotion:	16.12.2020