Dokument: The ATG8 Protein GABARAP in Secretion, Transport, and Autophagy
| Titel: | The ATG8 Protein GABARAP in Secretion, Transport, and Autophagy | |||||||
| Weiterer Titel: | Das ATG8-Protein GABARAP in Sekretion, Transport und Autophagie | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=55156 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210113-105715-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | M. Sc. Sanwald, Julia [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] PD Dr. rer. nat. Stork, Björn [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | GABARAP, autophagy, secretion, extracellular vesicle, proximity, Golgi | |||||||
| Dokumententyp (erweitert): | Dissertation | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die humane ATG8 (autophagy-related 8)-Proteinfamilie ist am besten bekannt für ihre grundlegenden Funktionen während der Autophagie, eines zellulären Prozesses, der dem Abbau zelleigener und -fremder Bestandteile und damit der Homöostase dient. Unterteilt wird die ATG8-Familie in zwei Subfamilien, die aus den je untereinander hochgradig homologen (MAP1)LC3s ((microtubule-associated proteins 1A/1B) light chain 3 ) und GABARAPs (γ-aminobutyric acid (A) receptor-associated proteins) bestehen. Aufgrund ihrer hohen Sequenzähnlichkeit sind die genauen Eigenschaften der einzelnen Familienmitglieder noch nicht vollständig bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, GABARAP auf seine spezifischen Funktionen besonders hinsichtlich Autophagie-unabhängiger Prozesse zu untersuchen.
Die Vielseitigkeit von GABARAP wird besonders durch dessen Beteiligung an den verschiedensten zellulären Prozessen, neben Autophagie auch Transport und Sekretion, verdeutlicht. GABARAP ist nicht nur in den Plasmamembran (PM)-gerichteten Transport anderer Proteine involviert. Auch an der vesikulären Sekretion von beispielsweise Insulin ist GABARAP beteiligt und wird, wie in dieser Arbeit durch immunologischen Nachweis von GABARAP in Lysaten extrazellulärer Vesikel (EVs) gezeigt wurde, auch selbst sekretiert. Um den Sekretionsmechanismus von GABARAP zu untersuchen, wurde die Methode der APEX2 (modifizierte Ascorbat-Peroxidase)-vermittelten Proxitom-Bestimmung angewandt. Diese Methode basiert auf der Oxidation von Biotin-Phenol zu einem kurzlebigen Radikal, das an Proteine in der direkten (proximalen) Umgebung des APEX2-Konstruktes bindet. APEX2-GABARAP wurde bereits für die Bestimmung des Proxitoms in Autophagosomen verwendet. Durch dessen Anwendung in EVs wurde hier zum ersten Mal die Eignung dieser Methode für kleine (~100 nm) extrazelluläre Kompartimente gezeigt. Mit Biotin-Phenol markierte Proteine wurden mittels Streptavidin angereichert und über Massenspektrometrie analysiert. Das resultierende APEX2-GABARAP EV-Proxitom oder "Co-Sekretom" enthält nicht nur bekannte GABARAP-Interaktoren wie Calreticulin oder Clathrin heavy chain 1, sondern auch typische exosomale Markerproteine wie Alix und Annexin V. Bei einer tiefergehenden Analyse des GABARAP Co-Sekretoms wurden außerdem eine Anreicherung mitochondrialer Proteine und ein Überlapp mit dem Autophagosomen-Proxitom von APEX2-GABARAP festgestellt. GABARAP könnte daher einerseits über einen unkonventionellen Sekretionsweg, bei dem Autophagosomen nicht degradiert, sondern sekretiert werden, aus der Zelle transportiert werden. Andererseits könnte GABARAP über einen Weg sekretiert werden, der kurz vor dieser Arbeit für sein Paralog LC3B unter Verwendung einer alternativen intrazellulären Biotinylierungsstrategie entdeckt wurde. Bei diesem LC3-basierten Sekretionsmechanismus kontrolliert unter anderem die ATG8-Konjugationsmaschinerie die Beladung einer Subpopulation intraluminaler Vesikel, z.B. mit RNA-bindenden Proteinen (RBPs), und letztlich deren MVB (multivesicular body)-vermittelter Sekretion. GABARAP und LC3 könnten in diesem Prozess eine funktionelle Redundanz aufweisen, da etliche RBPs, die im LC3-Proxitom gefunden wurden, auch im GABARAP Co-Sekretom vorhanden sind. Zusammengefasst könnte GABARAP demnach neben einem Autophagosomen-vermittelten Weg auch über einen MVB-vermittelten Weg, der sich nur der ATG8-Konjugationsmaschinerie bedient, sekretiert werden. Auch eine Kombination beider Mechanismen, bei der ein Autophagosom vor der Sekretion mit einem MVB zu einem Amphisom fusioniert, ist denkbar. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden GABARAP und dessen Paraloge GABARAP-like 1 (-L1) und GABARAP-like 2 (-L2) im Hinblick auf ihre Funktionen bei Transportmechanismen untersucht. Ursprünglich wurde GABARAP als Rezeptor-assoziiertes Protein identifiziert, das ebenso wie GABARAPL1 und -L2 an intrazellulären Transportvorgängen beteiligt ist. GABARAPL2 wurde zudem als essenzielles Protein für den Proteintransport innerhalb des Golgi-Apparates und die Erhaltung der Golgi-Morphologie beschrieben. Die Beteiligung von GABARAP an letzterem Prozess und von GABARAPL1 an beiden Prozessen wurde hingegen bis jetzt noch nicht untersucht. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit in HEK293 knockout (KO) Zelllinien, denen ein, zwei, oder alle drei Mitglieder (triple KO, TKO) der GABARAP-Subfamilie fehlen, der komplette Golgi oder das trans-Golgi Netzwerk gefärbt und anschließend mittels (Immun-)Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Dabei wurde ein signifikanter Einfluss von nicht nur GABARAPL2, sondern auch von GABARAP, auf die Golgi- Morphologie festgestellt. Nach Verlust von GABARAP und/oder GABARAPL2 wurde eine erhöhte Anzahl an Zellen ermittelt, die einen zerstreuten Golgi aufwiesen, im Gegensatz zu wildtypischen (WT-)Zellen, bei denen die meisten einen kompakten Golgi enthielten. In einem Lebendzell-Ceramid-chase-Experiment mit NBD-markiertem C6-Ceramid wurde für TKO-Zellen außerdem eine Akkumulation NBD-positiver, vesikulärer Strukturen und eine verringerte NBD-Färbung der PM im Vergleich zu WT-Zellen beobachtet. Dieser Phänotyp konnte mittels Monensin nachgestellt werden, ein Ionophor, das den trans-Golgi zerstört. Im Gegensatz dazu führte eine Inkubation der Zellen mit Brefeldin A (BFA) zu einer ähnlichen Verteilung von NBD C6-Ceramid in WT- und TKO-Zellen. Es ist bekannt, dass Ceramid non-vesikulär über das Ceramid Transferprotein (CERT) vom endoplasmatischen Retikulum (ER) zum cis-Golgi transportiert wird. Dieser Mechanismus ist vermutlich unbeeinflusst von BFA, da dieses vesikuläre, jedoch nicht non-vesikuläre Transportprozesse vom ER zum cis-Golgi inhibiert. Eine Beteiligung der GABARAPs im trans-Golgi-vermittelten, vesikulären, jedoch nicht am non-vesikulären, CERT-vermittelten Transport von Ceramid und dessen Metaboliten liegt daher nahe. Insgesamt führte die Abwesenheit der GABARAPs zu einer Veränderung der Golgi-Morphologie und des Lipidtransportes, wobei über eine funktionelle Redundanz von GABARAP und GABARAPL2 spekuliert werden kann. Der zugrundeliegende Mechanismus bleibt Gegenstand zukünftiger Studien. Parallel wurden Beiträge zu einer Studie geleistet, in der cytoplasmatische GABARAP-bzw. LC3B-enthaltende Strukturen, detektiert mittels enhanced yellow fluorescent protein (EYFP)-Fusion und Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie (single-molecule localisation microscopy, SMLM), untersucht wurden. Während eine ähnliche Größenverteilung festgestellt wurde, waren EYFP-GABARAP-gelabelte Strukturen vor allem kreisförmig und EYFP-LC3B-enthaltende Strukturen wiesen eher eine U-Form auf. Durch SMLM konnten somit LC3B und GABARAP unterschiedlichen Strukturen zugeordnet werden und deuten damit auf verschiedene Lokalisationen und folglich Funktionen der beiden ATG8-Proteine hin.The human ATG8 (autophagy-related 8) protein family is well-known for its fundamental functions during autophagy, a self-degradation process essential for cellular homeostasis. Subdivided into the two highly homologous subfamilies (MAP1)LC3s ((microtubule-associated proteins 1A/1B) light chain 3) and GABARAPs (γ-aminobutyric acid (A) receptor-associated proteins), the distinct roles of the individual family members are not yet entirely clear. The aim of this work was therefore to study GABARAP regarding its specific functions, especially during autophagy-independent processes. The versatility of GABARAP is illustrated by its participation in diverse cellular processes like transport and secretion pathways besides autophagy. GABARAP mediates not only the plasma membrane (PM)-directed transport of other proteins or vesicular secretion e.g. of insulin. In fact, by immunological detection of GABARAP in extracellular vesicle (EV) lysates this work also demonstrates the secretion of GABARAP itself. To investigate GABARAP's secretion pathway, the APEX2 (engineered ascorbate peroxidase) proximity labelling system was applied for the first time to EVs, proving its applicability to small (~100 nm) extracellular compartments. Following its activation, APEX2 catalyses the oxidation of biotin-phenol to a short-lived radical which subsequently labels proteins in direct proximity to the APEX2 construct. Tagged to GABARAP, APEX2 has already been used to determine the proxitome inside an autophagosome. Labelled proteins were enriched via Streptavidin and applied to mass spectrometry. By identifying the APEX2-GABARAP proxitome in EVs or its "cosecretome", respectively, not only GABARAP-interacting proteins like Calreticulin and Clathrin heavy chain 1 were detected, but also typical exosomal marker proteins such as Alix and Annexin V. Furthermore, an in-depth analysis of GABARAP's co-secretome revealed an enrichment of mitochondrial proteins and an overlap with an independently determined autophagosomal proxitome, suggesting a non-degradative autophagic pathway for GABARAP's secretion. Alternatively, GABARAP could be secreted via a pathway that, shortly before this work, was uncovered for GABARAP's paralogue LC3B by employing a different, intracellular proximity labelling approach. This LC3-based secretion mechanism involves the ATG8-conjugation machinery which controls the loading of e.g. RNA-binding proteins (RBPs) into a subpopulation of intraluminal vesicles, followed by multivesicular body (MVB)-mediated secretion. GABARAP and LC3 might be functionally redundant in this process, as several RBPs detected in LC3 proximity were also found in the GABARAP co-secretome. In summary, GABARAP might be secreted by an autophagosome-mediated pathway and/or by an MVB-mediated pathway employing the ATG8-conjugation machinery, or even by a combined mechanism involving a fusion step of an autophagosome with an MVB yielding an amphisome prior to secretion. As second part of this work, GABARAP and its paralogues GABARAP-like 1 (-L1) and -like 2 (-L2) were studied regarding their functions during transport processes. Initially, GABARAP was discovered as receptor-associated protein which takes part in intracellular trafficking events, a function which was also described for GABARAPL1 and -L2. Although GABARAPL2 was immediately defined as a protein essential for intra-Golgi trafficking and for Golgi restacking, the latter function has not yet been investigated for GABARAP and both functions not yet for GABARAPL1. To study this matter, HEK293 knockout (KO) cell lines lacking one, two, or all three (TKO) of the GABARAPs were applied to staining with markers targeting either the whole Golgi or the trans-Golgi network and subsequent (immuno-)fluorescence microscopy. In doing so, a significant influence of not only GABARAPL2, but also GABARAP, on Golgi morphology was observed, the loss of GABARAP and/or GABARAPL2 leading to an increased number of cells containing a dispersed Golgi compared to wild-type (WT) cells predominantly exhibiting a compact Golgi. In a live-cell ceramide chase experiment using NBD-labelled C6-ceramide, an accumulation of NBD-labelled, vesicular structures and reduced PM staining was observed in TKO cells compared to WT cells. This finding could be mirrored by Monensin which is known to disrupt the trans-Golgi. In contrast, incubation of the cells with Brefeldin (A) (BFA) led to a similar staining pattern in WT and TKO cells. Ceramide is known to be transported from the endoplasmic reticulum (ER) to the cis-Golgi by the ceramide transfer protein (CERT) in a non-vesicular manner. This mechanism is presumably not affected by BFA as it inhibits vesicular, but not non-vesicular ER-to-Golgi trafficking. Therefore, an involvement of the GABARAPs in trans-Golgi-mediated, vesicular trafficking, but not in CERT-mediated, non-vesicular trafficking of ceramide and its metabolites seems likely. Taken together, absence of GABARAPs resulted in a change in Golgi morphology and lipid trafficking, GABARAP and GABARAPL2 possibly being functionally redundant. The exact mechanisms of action are yet to elucidate in future work. In parallel, contributions were made to a comprehensive analysis of cytoplasmic structures containing GABARAP and LC3B, respectively, by enhanced yellow fluorescent protein (EYFP)-fusion and single-molecule localisation microscopy (SMLM). Thereby, a similar size distribution was revealed. However, EYFP-GABARAP containing structures were mainly circular, while EYFP-LC3B containing structures were predominantly U-shaped. SMLM therefore enabled an assignment of LC3B and GABARAP to different structures, indicating diverse localisations and hence functions of the two ATG8 proteins. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.01.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.01.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 08.09.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 10.11.2020 |
