Dokument: Die Rolle des Chaperons LipH bei der Produktion aktiver Lipase aus Pseudomonas aeruginosa: Struktur- und Funktionsuntersuchung mit Methoden der "Directed Evolution"
| Titel: | Die Rolle des Chaperons LipH bei der Produktion aktiver Lipase aus Pseudomonas aeruginosa: Struktur- und Funktionsuntersuchung mit Methoden der "Directed Evolution" | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5499 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20070814-140414-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Sadtler, Stefan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Lipasen bilden eine der wichtigsten Klassen von Enzymen, die in der organischen Chemie und in der Biotechnologie verwendet werden. Sie finden z.B. Verwendung in der enantioselektiven Produktion von Alkoholen, Aminen und Carbonsäuren. Ein essentieller Schritt für die Produktion enzymatisch aktiver und in das extrazelluläre Medium sekretierter Lipase ist die periplasmatische Faltung durch sowohl spezifische als auch unspezifische Faltungsmediatoren. Die Foldase LipH aus P. aeruginosa stellt einen solchen spezifischen Faltungshelfer dar. Die molekularen Mechanismen, die der Faltungskatalyse durch die Lipase-spezifischen Foldasen zugrunde liegen, sind aktuell noch ebenso wenig geklärt wie die physiologische Bedeutung. Mit Hilfe der gerichteten Evolution, d.h. mit dem Einfügen von Mutationen in das entsprechende Gen und nachfolgendem Screening der entstandenen Proteinvarianten, sowie in vitro-Analysen ausgesuchter LipH-Varianten wurden Erkenntnisse gesammelt, die der Aufklärung von Struktur- und Funktionsbeziehungen der Foldase aus P. aeruginosa dienen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mit Hilfe der fehlerhaften PCR eine LipH-Variantenbank erstellt, die eine Größe von 797.760.000 Transformanden hat. Die Erstellung eines vollständigen Alaninscans sollte im Gegensatz zur zufällig generierte LipH-Variantenbank die Möglichkeit bieten, gezielt definierte Bereiche der Foldase auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Letztendlich konnten mit 174 Konstrukten deutlich mehr als die Hälfte der gewünschten Einzelsubstitutionen amplifiziert und kloniert werden, ihre Anwendung in der detaillierten Analyse definierter Bereiche der Foldase finden und so zur Erweiterung des grundlegenden Verständnisses in der Proteinfaltung beitragen. Dieses Projekt sollte neben der Aufklärung von Struktur- und Funktionsbeziehungen nicht zuletzt auch einen neuen Ansatz der Optimierung eines Enzyms über die gerichtete Evolution des Chaperons darstellen. Im sich anschließenden Screening konnten LipH-Varianten mit einem oder mehreren AS-Austauschen identifiziert werden, die zum einen eine deutliche Reduzierung, zum anderen aber auch eine drastische Steigerung der Lipaseaktivität bewirkten. Es war erstmals möglich, die Eigenschaft eines Enzyms über die gerichtete Evolution des Chaperons zu optimieren. Im Hinblick auf Struktur- und Funktionsbeziehungen konnte gezeigt werden, dass Alanin103 als Bestandteil des konservierten Motivs (Rx1x2FDY(F/C)L(S/T)A) vermutlich direkt an der Interaktion zwischen Lipase und Foldase beteiligt ist. Der Spacer-Region konnte - nicht zuletzt durch sich anschließende Sättigungsmutagenesen - eine wichtige Funktion in der Lipaseaktivierung und eventuell sogar in der Sekretion zugesprochen werden. Dabei scheint die Position Prolin234 eine Schlüsselfunktion in der Lipaseaktivierung einzunehmen. Eine C-terminale Verlängerung der Foldase um 67 AS hatte eine verbesserte Lipaseaktivierung im heterologen Wirt sowie in in vitro-Versuchen zur Folge und ist daher durchaus von biotechnologischem Interesse. Eine Verkürzung der C-terminalen Minidomäne um 62 AS hingegen verdeutlich die Wichtigkeit dieser Region, da diese lediglich eine 6 %ige Lipaseaktivierung im Vergleich zur WT-Variante zuließ. Austausche im C-Terminus weisen auf eine Interaktion des C-Terminus mit anderen Proteinen, möglicherweise der Xcp-Maschinerie, hin. Dem N-Terminus der Foldase wurde bislang lediglich die Funktion als Membrananker und „Abstandshalter“ für die Ermöglichung der Lipaseinteraktion zugesprochen. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch über N-terminale AS-Austausche, eine N-terminale Verkürzung der Foldase sowie über sich anschließende in vitro-Versuche gezeigt werden, dass der N-Terminus Voraussetzung für die Sekretion aktiver Lipase über die TypII-Maschinerie ist.Lipases represent one of the most important classes of enzymes applied in organic chemistry and biotechnology. They are used for the enantioselective production of alcohols, amines and carboxylic acids. An essential step for the production of enzymatically active secreted lipase is the periplasmatic folding mediated by specific and unspecific folding mediators. The P. aeruginosa foldase LipH is one of these specific folding catalysts. Directed evolution by the insertion of mutations in the gene and subsequent screening of the protein variants, as well as in vitro analysis of LipH variants contributed to an understanding of the structure-function-relationship of the P. aeruginosa foldase. In the first part of this thesis, a LipH variant library was constructed by epPCR which had a size of 797.760.000 clones. An alaninescanning mutagenesis provides the opportunity to analyse defined regions of the foldase. 174 constructs, far more than the half of the desired singlesubstitutions, could be amplified and cloned. They can add to the general knowledge of protein folding. This project was supposed to be a new approach of optimisation of an enzyme by directed evolution of its chaperone. In the following screening, foldase variants with one or more amino acid (aa) substitutions were identified, on the one hand causing a decrease and on the other hand causing an increase in lipase activity. For the first time, it was possible to optimise the features of an enzyme by directed evolution of its chaperone. Concerning aspects of structure and function relationships it was shown that alanine103 as a part of the conserved motive (Rx1x2FDY(F/C)L(S/T)A) is probably directly involved in the interaction between lipase and foldase. The following saturation mutagenesis revealed that the spacer-region has an important function in lipase activation and possibly even in secretion. Amino acid proline234 seems to have a key function in lipase activation. A 67 aa C-terminal elongation of the foldase resulted in an improved lipase activation in the heterologous host as well as in in vitro experiments. From the biotechnological point of view this improvement is very interesting. However, the 62 aa truncation of the C-terminal mini-domain demonstrated the importance of this region, since it allowed only a 6 % lipase activity in comparison to the wild type variant. C-terminal substitutions indicated an interaction of the C-terminal domain with other proteins, presumably of the Xcp-machinery. Up to now, the N-terminal-domain of the foldase was regarded to function as a membrane anchor and a “spacer” enabling interaction with the lipase. In this thesis, N-terminal substitutions, a N-terminal truncation of the foldase and in vitro experiments showed that the N-terminal-domain is necessary for the secretion of active lipase by the typeII-secretion machinery. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 14.08.2007 | |||||||
| Dateien geändert am: | 14.08.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 02.05.2007 | |||||||
| Datum der Promotion: | 27.06.2007 |
