Dokument: Der Einfluss von zirkadianer Rhythmik und oxidativem Stress auf den Metabolismus von Astrozyten Auswirkungen auf die molekulare Uhr, Mitochondrien und Superoxid-Dismutasen

Titel:	Der Einfluss von zirkadianer Rhythmik und oxidativem Stress auf den Metabolismus von Astrozyten Auswirkungen auf die molekulare Uhr, Mitochondrien und Superoxid-Dismutasen
Weiterer Titel:	The influence of circadian rhythm and oxidative stress on the metabolism of astrocytes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54947
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20201211-134316-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Leonhardt, Maya-Lynn [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,79 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.12.2020 / geändert 04.12.2020
Beitragende:	Prof. Dr. von Gall, Charlotte [Gutachter] Prof. Dr. Weggen, Sascha [Gutachter]
Stichwörter:	Astrozyten, molekulare Uhr, Superoxiddismutasen, oxidativer Stress
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Neurodegenerative Erkrankungen nehmen in ihrer Prävalenz stetig zu, trotzdem ist bis dato noch keine kausale Therapie bekannt (Cao et al., 2020). Neue Erkenntnisse belegen, dass Astrozyten an Ursprung und Folgen von neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind (Phatnani and Maniatis, 2015). Die Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen ist multifaktoriell, ein ätiopathologischer Faktor ist oxidativer Stress (Simonian and Coyle, 1996). Symptomatisch führen viele neurodegenerative Erkrankungen im frühen Stadium zu Schlafstörungen und Störungen im Schlaf-Wach-Rhythmus (Videnovic et al., 2014). Die Auswirkung von oxidativem Stress auf die zirkadiane Rhythmik von Astrozyten ist bis dato noch nicht vollständig untersucht (Chen et al., 2020). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von zirkadianer Rhythmik und oxidativem Stress auf das molekulare Uhrwerk, die Mitochondrien und die Superoxid-Dismutasen in der primären Astrozyten-Zellkultur näher untersucht. Diese Arbeit liefert somit eine wichtige Grundlage die rhythmische Astrozytenfunktion im Kontext von neurodegenerativen Erkrankungen besser zu verstehen und darauf aufbauend neue Therapiekonzepte abzuleiten. Die Versuche wurden an primären Astrozyten-Zellkulturen von transgenen Mäusen durchgeführt, die ein Fusionsprotein aus einem rhythmischen Uhren-Gen und Luciferase exprimieren (PER2::LUC-Mäuse). Mit Hilfe dieses Reporter-Konstrukts kann die rhythmische Uhren-Genexpression und somit die Funktion des molekularen Uhrwerks über mehrere Tage in Echtzeit im Luminometer verfolgt werden. Das Toxin Rotenon wurde zur Induktion von oxidativem Stress in Form von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verwendet. Die Analyse der mitochondrialen Gene, mfn2, fis1 und nd1, erfolgte mittels real time Polymerase Kettenreaktion (PCR). Die Untersuchungen zu den antioxidativen Enzymen Superoxid-Dismutase (SOD) 1 und 2 erfolgte mittels real time PCR und mittels Western-Blot. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen, dass die zirkadiane Rhythmik von Astrozyten, gemessen an der PER2::LUC-Expression, durch oxidativen Stress beeinflusst wird. Es konnte allerdings kein Einfluss von zirkadianer Rhythmik oder oxidativem Stress auf die mitochondrialen Gene mfn2, fis1 und nd1 in Astrozyten nachgewiesen werden. Doch es wurde gezeigt, dass die SOD1 und SOD2 in Astrozyten zirkadian exprimiert werden. Diese zirkadiane Expression wird bei der SOD1 durch oxidativen Stress beeinflusst, während die SOD2 davon unabhängig exprimiert werden. Die Regulation der SOD scheint auf Protein- und nicht auf Gen-Ebene stattzufinden. Es ist bekannt, dass PER2::LUC in Astrozyten rhythmisch exprimiert wird (Prolo et al., 2005), doch der Einfluss von oxidativem Stress wurde bis dato nur in anderen Geweben untersucht (Yu Tahara*, 2016). In Fibroblasten zeigt sich beispielsweise durch ROS eine Phasenverschiebung (Yu Tahara*, 2016) der PER2::LUC-Expression, während es in Astrozyten zu einer Abschwächung der Expressions-Amplitude kommt. Die Geschlechterunterschiede in der Reaktion auf oxidativen Stress in der Harderschen Drüse von Hamster (Coto-Montes et al., 2001) konnten in der PER2::LUC-Expression von Astrozyten jedoch nicht reproduziert werden. Die Gene der Fusions-Maschinerie mfn2 und der Fissions-Maschinerie fis1 werden in anderen Geweben in Abhängigkeit von der molekularen Uhr exprimiert (Jacobi et al., 2015, Kohsaka et al., 2014). In der vorliegenden Arbeit konnte kein Zusammenhang der Gen-Expression mit PER2 nachgewiesen werden und keine Beeinflussung der Expression durch oxidativen Stress. Dass SOD in Ratten-Kortizes zeitabhängig aktiv sind, ist bereits bekannt (Diaz-Munoz et al., 1985), doch dass SOD1 und SOD2 in Astrozyten zirkadian, in Abhängigkeit von PER2, exprimiert werden, ist eine neue Erkenntnis dieser Arbeit. Im Einklang mit den Ergebnissen von Pinteaux et al. wird die SOD1 durch oxidativen Stress in geringerer Konzentration exprimiert und die SOD2 in höherer Konzentration (Pinteaux et al., 1996). Da es sich um eine Zellkultur im Maus-Modell handelt, ist die Übertragbarkeit auf den Menschen eingeschränkt, trotzdem ist der Zusammenhang von zirkadianer Rhythmik und oxidativem Stress in Astrozyten eine wichtige Erkenntnis, aus der sich weitere Untersuchungen ableiten lassen. Although the prevalence of neurodegenerative diseases is increasing, a therapy addressing causal mechanism has not yet been identified (Cao et al., 2020). New findings show that astrocytes are involved in the origin and effect of neurodegenerative diseases (Phatnani and Maniatis, 2015). The origin of neurodegenerative diseases is multifactorial, but one important etiopathologic factor is known to be oxidative stress (Simonian and Coyle, 1996). In early stages symptoms of many neurodegenerative disease lead to sleeping disorders and to disturbance of the day-night-rhythm (Videnovic et al., 2014). The influence of oxidative stress on the circadian rhythm of astrocytes has not yet been fully discovered (Chen et al., 2020). In the present work the influence of circadian rhythm and oxidative stress on the molecular clock, the mitochondria and the superoxide dismutase has been investigated. This work provides an important basis to better understand the rhythmic astrocyte function in the context of neurodegenerative diseases and to use this to derive new therapy concepts. The experiments were run using primary astrocyte cell cultures of transgenic mice, which express a fusion protein of a rhythmic clock gene and a Luciferase (PER2::LUC- mice). With the help of this reporter construct the rhythmic clock gene expression and consequently the function of the molecular clock can be detected for several days in the luminometer. Toxin Rotenone was used to induce oxidative stress in form of reactive oxygen species (ROS). The analyses of the mitochondrial genes mfn2, fis1 and nd1 was conducted via real time polymerase chain reaction (PCR). The antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD) 1 and 2 were analyzed using real time PCR and Western-Blot. The results of this work provide evidence for the circadian rhythm of astrocytes as detected by the PER2::LUC-expression, being influenced by oxidative stress. However, the mitochondrial genes mfn2, fis1 and nd1 do not seem to be influenced by oxidative stress or the circadian clock. Yet the SOD1 and SOD2 in astrocytes seem to be expressed dependent on circadian rhythm. In SOD1 circadian expression is affected by oxidative stress, while it is independently expressed in SOD2. The regulation of the SOD seems to take place on protein-level, but not on gene-level. It is established that PER2::LUC is expressed rhythmically in astrocytes (Prolo et al., 2005), but until now the influence of oxidative stress has only been examined in other tissues (Yu Tahara*, 2016). For example fibroblasts show a phase shift after ROS induction (Yu Tahara*, 2016), while astrocytes show an attenuation of expression amplitudes. Yet the sex differences in the reaction to oxidative stress in the Hardersche gland of hamster (Coto-Montes et al., 2001), could not be reproduced in the PER2::LUC-expression of astrocytes. The genes of the fusion machinery mfn2 and the fission machinery fis1 have been shown to be dependent on the circadian clock in other tissues (Jacobi et al., 2015, Kohsaka et al., 2014) in the present work, however, no connection of the gene expression with PER2 or oxidative stress could be verified. It has already been established that the activity of SOD in the cortices of rats is time dependent (Diaz-Munoz et al., 1985), but this work contributes the novel insight that SOD1 and SOD2 in astrocytes are also expressed with a circadian rhythm, which is dependent on PER2. In line with the results of Pinteaux et al. the SOD1 is expressed in a lower concentration through oxidative stress while the SOD2 is expressed in a higher concentration (Pinteaux et al., 1996). Since the experiments were performed in a cell culture of a mouse model the transferability to humans is limited. Yet the connection of circadian rhythm and oxidative stress in astrocytes is an important finding from which further investigations can be derived.
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Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Anatomie II
Dokument erstellt am:	11.12.2020
Dateien geändert am:	11.12.2020
Promotionsantrag am:	11.05.2020
Datum der Promotion:	24.11.2020