Dokument: Pseudomonas putida als Zellfabrik zur Produktion von Rhamnolipiden

Titel:	Pseudomonas putida als Zellfabrik zur Produktion von Rhamnolipiden
Weiterer Titel:	Pseudomonas putida as a cell factory for the production of rhamnolipids
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54809
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20201124-104901-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kubicki, Sonja [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 20,07 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.11.2020 / geändert 19.11.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Stichwörter:	Biotenside, Rhamnolipide, heterologe Expression, Pseudomonas putida KT2440, synthetische Biologie, induzierbare Promotoren, Metabolic Engineering, yTREX-Toolbox, VPBO-Assay, Produktionsstabilität
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Rhamnolipide sind mikrobielle Tenside, die aufgrund vielversprechender Eigenschaften als Alternative zu den kommerziell weit verbreiteten Erdöl-basierten Tensiden angesehen werden. Die biotechnologische Anwendbarkeit von Rhamnolipiden wird derzeit unter anderem durch die natürliche komplexe Regulation der Biosynthese, die Pathogenität oder die schwierige technologische Zugänglichkeit von Ursprungsorganismen erschwert. Als vielversprechende Alternative wurde Pseudomonas putida KT2440 in der Vergangenheit für die heterologe Produktion von Rhamnolipiden etabliert. Bislang wurden in entsprechenden Studien überwiegend Plasmide mit starken synthetischen Promotoren zur Expression des für die Produktion von Monorhamnolipiden (mRL) kodierenden rhlAB-Operons verwendet. Im Gegensatz dazu gelten im Allgemeinen genomintegrierte Expressionskassetten als besser geeignet zur Konstruktion von stabilen Produktionsstämmen. Die Ziele dieser Arbeit bestanden darin, (i) Werkzeuge zur schnellen und effizienten Konstruktion stabiler P. putida-Produzenten bereitzustellen, (ii) die Rhamnolipid-Produktion in verschiedenen Stämmen zu charakterisieren, (iii) anschließend den Produktionstiter zu optimieren sowie schließlich (iv) die Breite des Anwendungspotenzials der selektierten Expressionskassette zu evaluieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die attTn7-Integration vermittelnde Transfer- und Expressions- (yTREX) toolbox entwickelt sowie der Victoria Pure Blue BO-Assay zur Tensid-Detektion etabliert. Diese neuen Werkzeuge ermöglichten die effektive Konstruktion eines Sets an Stämmen mit neuen Expressionskassetten und die in dieser Form erstmalig durchgeführten komparativen Expressionsstudien mit verschiedenen Promotoren zur Untersuchung von deren Einfluss auf die Genexpression, Stammstabilität, Produktivität und den Rhamnolipid-Titer (i). Bemerkenswerterweise ging bei der Verwendung starker, konstitutiver Promotoren die Fähigkeit zur Bildung von Rhamnolipiden verloren, was auf einen negativen Selektionsdruck durch Rhamnolipid-Produktion hindeutete. Die Induktor-gesteuerten Expressionssysteme, hier erstmalig im Kontext der Rhamnolipid-Biosynthese angewendet, zeigten dagegen eine effiziente Zielgenexpression verbunden mit einer herausragenden Stabilität der Produktionsstämme (ii). Insgesamt führte das Salicylat-induzierbare, PnagAa-vermittelte rhlAB-Expressionssystem zu den besten Produktionseigenschaften. Die Optimierung des Rhamnolipid-Titers und die vollständige Umsetzung der Vorstufe HAA konnte durch Verwendung eines genomreduzierten Stammhintergrunds, und auch durch heterologe Koexpression relevanter Edukt-Synthasen erreicht werden. Im (Mikro )Batch-Maßstab zeigte der finale Produzent P. putida KTsalmRL+Rha+G1P einen mRL-Titer von 1,45 g/L bei einer Induktorkonzentration von 2 mM Salicylat (iii). Abschließend konnte die breitere Anwendbarkeit dieses Expressionssystems durch Produktion von unterschiedlichen Rhamnolipid-Kongeneren gezeigt werden (iv). Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals eine Induktor-basierte Expression von stabil in das bakterielle Genom integrierten rhlAB-Genen und eine damit vielversprechende Rhamnolipid-Produktion gezeigt werden. Die neu konstruierte Expressions-toolbox sowie der VPBO Assay tragen auch über die konkrete Anwendung in diesem Kontext hinaus zur Etablierung von mikrobiologisch produzierten Sekundärmetaboliten als ein Baustein auf dem Weg zu einer Bio basierten Ökonomie bei. Rhamnolipids are microbial surfactants considered to be an alternative for commercially widespread petroleum-based surfactants due to their promising properties. Their origin from opportunistically human pathogenic producers and the complex regulation of rhamnolipid production poses a challenge in the establishment of production processes. Pseudomonas putida KT2440 has emerged as an alternative heterologous production host for rhamnolipids exhibiting promising properties with respect to the rhamnolipid tolerance and yields. Most studies so far applied plasmids with strong synthetic promoters for the expression of the monorhamnolipid biosynthesis genes rhlAB. On the contrary, genome-integrated expression cassettes are considered more suitable for the construction of stable production strains in general. The aims of this thesis were to (i) provide tools for the rapid and efficient construction of stable P. putida rhamnolipid producer strains, (ii) characterize rhamnolipid production in different strain, (iii) optimize the production titers and (iv) evaluate the further application potential of the best-performing cassette. Within the scope of this work, the attTn7 integration mediating transfer and expression- (yTREX) toolbox was developed and the Victoria Pure Blue BO- (VPBO) assay for surfactant detection was established. These new tools allowed the effective construction of a set of strains with new expression cassettes and for the first time performed comparative expression studies with different promoters to investigate their influence on rhlAB expression, strain stability, productivity, and product titers (i). Remarkably, expression controlled by strong constitutive promoters evoked a rapid loss of rhamnolipid formation capacity; apparently because rhamnolipid production might exert a negative selection pressure. In contrast, the tested inducer-controlled expression systems, here applied for the first time in the context of rhamnolipid biosynthesis, lead to high-level expression of target genes and improved strain stability (ii). Comparative studies revealed that the salicylate-inducible PnagAa-controlled expression system resulted in highest product titers. The optimization of the rhamnolipid titer and the almost complete conversion of the precursor HAA could be achieved by using a genome-reduced strain background as well as by the genome-integrated heterologous co-expression of relevant precursor synthases. At micro-fermentation scale, the final producer strain P. putida KTsalmRL+Rha+G1P yielded an mRL titer of 1.45 g/L at an inducer concentration of 2 mM salicylate (iii). Finally, the broader applicability of this expression system was shown by production of different rhamnolipids in terms of chain length and rhamnose residues (iv). In summary, the present work demonstrated for the first time an inductor-based expression of rhlAB-genes which were stably integrated into the bacterial genome and a promising rhamnolipid production could be achieved. The here developed expression toolbox and the VPBO-assay may also contribute to the establishment of microbiologically produced secondary metabolites as a building block on the road to a bio-based economy beyond the mere development of rhamnolipid producers.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	24.11.2020
Dateien geändert am:	24.11.2020
Promotionsantrag am:	25.08.2020
Datum der Promotion:	05.11.2020