Dokument: Decoding the biosynthesis and transport of α-glucans in Mycobacterium tuberculosis

Titel:	Decoding the biosynthesis and transport of α-glucans in Mycobacterium tuberculosis
Weiterer Titel:	Entschlüsselung der Biosynthese und des Transports von α-Glucanen bei Mycobacterium tuberculosis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54764
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20201124-105516-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	MSc Babu Sait, Mohammed Rizwan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,42 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.11.2020 / geändert 13.11.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Kalscheuer, Rainer [Gutachter] Prof.Dr. Jacobsen, Marc [Gutachter]
Stichwörter:	Mycobacterium tuberculosis, MGLP, PPE51
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Tuberkulose (TB) ist eine der weltweit häufigsten Todesursachen, die durch einen einzigen infektiösen Organismus, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), verursacht wird und von dem jedes Jahr Millionen Menschen betroffen sind. Es gab keine anderen Stauseen für Mtb außer Menschen. Daher hat sich dieser Erreger weiterentwickelt und sein Stoffwechsel- und Virulenzsystem angepasst, um in menschlichen Makrophagen zu wachsen und sich zu vermehren. Die einzigartige Zellhülle von Mtb besteht aus verschiedenen Glykokonjugaten, die entweder wesentliche Strukturkomponenten oder Virulenzdeterminanten sind. Mtb produziert auch intrazelluläre Glykokonjugate wie Trehalose- und Methylglucoselipopolysaccharide (MGLP), die entscheidend an der Lebensfähigkeit und Virulenz des Bazillus beteiligt sind. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf die Charakterisierung des Metabolismus, der Biosynthese und des Transports von Trehalose und MGLP in Mtb. In Kapitel 3 wurde der Transport von Trehalose durch die äußere Mykolsäure enthaltende Mycomembran untersucht. Es wurde zuvor gezeigt, dass der ABC-Transporter LpqY-SugA-SugB-SugC die spezifische Aufnahme von Trehalose über die cytoplasmatische Membran vermittelt. Es war jedoch nicht bekannt, wie der Transport von Trehalose durch die Mycomembran vermittelt wird. In dieser Studie wurde die antimykobakterielle Aktivität von 6-Azido-Trehalose genutzt, um spontan resistente Mtb-Mutanten in einem merodiploiden Stamm auszuwählen, der zwei LpqY-SugA-SugB-SugC-Kopien enthält. Mutationen, die Resistenz gegen 6-Azido-Trehalose vermitteln, sind auf das Mitglied der Prolin-Prolin-Glutamat (PPE) -Familie PPE51 (Rv3136) abgebildet, von dem kürzlich gezeigt wurde, dass es ein integrales Mycomembranprotein ist, das an der Aufnahme mehrerer niedermolekularer Verbindungen, einschließlich einiger Mono, beteiligt ist - und Disaccharide. Eine ortsspezifische ppe51-Gendeletionsmutante von Mtb konnte nicht auf Trehalose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Darüber hinaus bestätigte die bioorthogonale Markierung von Zellen der mit 6-Azido-Trehalose inkubierten Mtb-Δppe51-Mutante die beeinträchtigte Internalisierung. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass der Transport von Trehalose und Trehalose-Analoga durch die Mycomembran von Mtb ausschließlich durch PPE51 vermittelt wird. Mtb produziert auch oligomere Glykokonjugate des cytoplasmatischen Komplexes wie 6-O-Methylglucose-Lipopolysaccharide (MGLP), die in vitro mit Fettacylketten und Acyl-CoA einen stabilen Komplex im Verhältnis 1: 1 bilden können. Dabei wurde MGLP vorgeschlagen, um die enzymatische Aktivität der Fettsäuresynthase I zu regulieren. Bisher konnte die biologische Funktion von MGLP jedoch aufgrund des Fehlens von Mtb-Mutantenstämmen, die eine wesentliche Verringerung der MGLP-Bildung zeigen, nie validiert werden. MGLP umfasst 10-20 Glucose- oder 6-O-Methylglucose-Einheiten mit zusätzlichen 3-O-Methylglucose-Einheiten am nicht reduzierenden Ende und Diglucosylglycerat (DGG) als Startereinheit am reduzierenden Ende. Die Bildung von DGG aus Glucosylglycerat ist ein wesentlicher Schritt bei der Synthese von MGLP. In Kapitel 4 nehmen wir an, dass das Enzym, das die DGG-Bildung katalysiert, ein Verzweigungsenzym ist, das vom essentiellen Rv3031-Gen kodiert wird. Eine bedingte Rv3031-Mutante wurde in Mtb H37Rv durch Insertion einer Tetracyclin-regulierbaren synthetischen Promotor-Kassette unmittelbar vor dem Startcodon von Rv3031 unter Verwendung einer speziellen Transduktion erzeugt. Wir haben die Wesentlichkeit des Gens durch bedingte Stummschaltung validiert. Wir führten eine proteomische Profilierung der bedingten Mutante sowohl unter vollständig induzierten als auch unter teilweise stillgelegten Bedingungen durch, um unterschiedliche Expressionsniveaus von Proteinen zu beobachten, die mit der Mykolsäurebiosynthese und Mycomembranproteinen zusammenhängen. Mykolsäuremethylester wurden extrahiert, um den Mykolsäuregehalt bei verschiedenen Genexpressionsniveaus von Rv3031 zu überwachen. Zusammengenommen liefern die Ergebnisse die Grundlage für das Verständnis der Rolle des mutmaßlichen Verzweigungsenzyms Rv3031 bei der MGLP-Biosynthese in Mtb. Schlechte Diagnosewerkzeuge zur Erkennung aktiver Krankheiten begrenzen Tuberkulose-Bekämpfungsprogramme und beeinträchtigen die Patientenversorgung. Eine genaue Erkennung von lebendem Mtb könnte die Tuberkulose-Diagnose und die Behandlung des Patienten verbessern. In Kapitel 5 berichten wir, dass Mykobakterien und andere Corynebakterien mit einem fluorogenen Trehaloseanalogon spezifisch nachgewiesen werden können. Wir haben eine 4-N, N-Dimethylamino-1,8-naphthalimid-konjugierte Trehalose (DMN-Tre) -Sonde entwickelt, die beim Übergang von wässriger zu hydrophober Umgebung eine> 700-fache Zunahme der Fluoreszenzintensität erfährt. Diese Verbesserung tritt bei der metabolischen Umwandlung von DMN-Tre in Trehalosemonomykolat und beim Einbau von Actinobakterien in die Mycomembran auf. Die DMN-Tre-Markierung ermöglichte die schnelle Visualisierung von mykobakteriellen und corynebakteriellen Spezies ohne Waschen ohne unspezifische Markierung von grampositiven oder gramnegativen Bakterien. Die DMN-Tre-Markierung wurde innerhalb von Minuten nachgewiesen und durch Hitzetötung von Mykobakterien gehemmt. Darüber hinaus wurde die DMN-Tre-Markierung im Gegensatz zur klinisch verwendeten Auramin-Färbung durch Behandlung mit TB-Arzneimitteln reduziert. Schließlich ist die DMN-Tre-Markierung eine betrieblich einfache Methode, die zur schnellen Diagnose von Tuberkulose eingesetzt werden kann. Tuberculosis(TB) is one of the leading causes of death in the world caused by a single infectious organism, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), affecting millions of people every year. There have been no other reservoirs for Mtb except humans. Hence, this pathogen evolved adapting its’ metabolism and virulence system to grow and multiply in human macrophages. The unique cell envelope of Mtb consist of different glycoconjugates that are either essential structural components and virulence determinants. Mtb also produces intracellular glycoconjugates such as trehalose and methyl glucose lipopolysaccharides (MGLP) that are crucially involved in viability and virulence of the bacillus. In this thesis, we focus on the characterization of the metabolism, biosynthesis and transport of trehalose and MGLP in Mtb. In Chapter 3, the transport of trehalose across the outer mycolic acid-containing mycomembrane was investigated. The ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC has previously been demonstrated to mediate the specific uptake of trehalose across the cytoplasmic membrane. However, it was unknown how transport of trehalose across the mycomembrane is mediated. In this study, the anti-mycobacterial activity of 6-Azido trehalose was harnessed to select for spontaneous resistant Mtb mutants in a merodiploid strain harbouring two LpqY-SugA-SugB-SugC copies. Mutations mediating resistance to 6-Azido trehalose mapped to the proline-proline-glutamate (PPE) family member PPE51 (Rv3136), which has recently been shown to be an integral mycomembrane protein involved in uptake of several low-molecular weight compounds including some mono- and disaccharides. A site-specific ppe51 gene deletion mutant of Mtb was unable to grow on trehalose as the sole carbon source. Furthermore, bioorthogonal labelling of cells of the Mtb Δppe51 mutant incubated with 6-Azido trehalose corroborated the impaired internalization. Taken together, the results indicate that the transport of trehalose and trehalose analogues across the mycomembrane of Mtb is exclusively mediated by PPE51. Mtb also produces cytoplasmic complex oligomeric glycoconjugates such as 6‐O‐methylglucose lipopolysaccharides (MGLP) that can form 1:1 ratio stable complex with fatty acyl chains and Acyl‐CoA in vitro. Thereby, MGLP have been proposed to regulate the enzymatic activity of fatty acid synthase I. However, so far the biological function of MGLP could never been validated because of the lack of Mtb mutant strains that exhibit a substantial reduction in MGLP formation. MGLP comprises 10‐20 glucose or 6‐O‐methylglucose units with additional 3‐O‐methylglucose units at the non‐reducing end and diglucosylglycerate (DGG) as a starter unit at the reducing end. The formation of DGG from glucosylglycerate is an essential step in the synthesis of MGLP. In Chapter 4, we hypothesize that the enzyme catalysing DGG formation is a branching enzyme encoded by the essential Rv3031 gene. A conditional Rv3031 mutant was generated in Mtb H37Rv by inserting a tetracycline‐regulatable synthetic promoter cassette immediately upstream of the start codon of Rv3031 employing specialized transduction. We validated the essentiality of the gene by conditional silencing. We performed proteomic profiling of the conditional mutant under both fully induced and partially silenced conditions to observe different expression levels of proteins related to mycolic acid biosynthesis and mycomembrane proteins. Mycolic acid methyl esters were extracted to monitor the mycolic acid content at different gene expression levels of Rv3031. Taken together, the results provide the basis for understanding the role of the putative branching enzyme Rv3031 in the MGLP biosynthesis in Mtb. Poor diagnostic tools to detect active disease limit tuberculosis control programs and affect patient care. Accurate detection of live Mtb could improve tuberculosis diagnosis and patient treatment. In Chapter 5, we report that mycobacteria and other corynebacteria can be specifically detected with a fluorogenic trehalose analog. We designed a 4-N, N-dimethylamino-1,8-naphthalimide–conjugated trehalose (DMN-Tre) probe that undergoes >700-fold increase in fluorescence intensity when transitioned from aqueous to hydrophobic environments. This enhancement occurs upon metabolic conversion of DMN-Tre to trehalose monomycolate and incorporation into the mycomembrane of Actinobacteria. DMN-Tre labelling enabled the rapid, no-wash visualization of mycobacterial and corynebacterial species without nonspecific labelling of Gram-positive or Gram-negative bacteria. DMN-Tre labelling was detected within minutes and was inhibited by heat killing of mycobacteria. Furthermore, DMN-Tre labelling was reduced by treatment with TB drugs, unlike the clinically used Auramine stain. Lastly, DMN-Tre labelling is an operationally simple method that may be deployable for rapid diagnosis of tuberculosis.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	24.11.2020
Dateien geändert am:	24.11.2020
Promotionsantrag am:	01.03.2017
Datum der Promotion:	11.11.2020