Dokument: Werkzeuge zur Darstellung der subzellulären Lokalisation und funktionellen Charakterisierung von GABARAP und deren Anwendung

Titel:	Werkzeuge zur Darstellung der subzellulären Lokalisation und funktionellen Charakterisierung von GABARAP und deren Anwendung
Weiterer Titel:	Tools for visualizing the subcellular localization and functional characterization of GABARAP and its application
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54741
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20201112-083254-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Simons, Indra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 83,74 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.11.2020 / geändert 11.11.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] PD Dr. rer. nat. Stork, Björn [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Spätestens seit Verleihung des Nobelpreises an Yoshinori Ohsumi im Jahr 2016 für die Entdeckung der AuTophaGy related (Atg) Proteine in Hefe steht die humane Proteinfamilie der ATG8s im Fokus der wissenschaftlichen Forschung. Die ATG8-Familie besteht aus der γ-aminobutyric acid A (GABAA) receptor-associated protein like-1/-2 (GABARAP/-L1/-L2) und der microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3 (MAP1A/1B LC3) A, -B, -B2, -C Unterfamilie. Die ATG8-Proteine sind sowohl für Autophagie-abhängige als auch Autophagie-unabhängige Prozesse in Zellen relevant. Neben den wichtigen Aufgaben während der Autophagie, einem dynamischen Prozess, der einen Abbau- und Recycling-Weg zelleigener und -fremder Bestandteile darstellt, wurde GABARAP zuerst als ein GABAA-Rezeptor assoziiertes Protein, das den Transport des Rezeptors zur Plasmamembran vermittelt, beschrieben. Die ATG8-Proteinfamilie ist evolutionär hoch konserviert und weist eine hohe Sequenz- und Strukturhomologie vor allem innerhalb der jeweiligen Unterfamilie auf. Eine genaue Unterscheidung der ausgeübten Funktionen der einzelnen ATG8-Mitglieder auf endogenem Niveau ist bislang aufgrund mangelnder Methoden und Werkzeuge zur gezielten Untersuchung kaum möglich. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, Werkzeuge zur differenzierten Untersuchung der einzelnen ATG8-Mitglieder zu etablieren und anschließend zur Erforschung spezifischer Rollen und Funktionen, insbesondere der GABARAP-Proteinfamilie, einzusetzen. Zunächst wurden innerhalb unserer Arbeitsgruppe Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9) knockout (KO) Plasmide kloniert und die KO-Zelllinien generiert. Anschließend wurde ein in Kooperation mit der Monoclonal Antibody Core Facility des Helmholtz Zentrums München entwickelter anti-GABARAP Antikörper mit Hilfe diverser KO-Zelllinien getestet und validiert. Dabei zeigte sich in den Immunfluoreszenz (IF)-Färbungen eine hohe Spezifität für GABARAP, ohne mit LC3s und den nahe verwandten Proteinen GABARAPL1 und -L2 kreuzzureagieren. Die GABARAP KO-Zelllinien waren zudem für die Untersuchung des Einflusses einer GABARAP-Defizienz bei der Endozytose des epidermalen Wachstums-Rezeptors (epidermal growth factor receptor, EGFR) grundlegend. Innerhalb unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass in GABARAP KO-, aber nicht in GABARAPL1 KO- und GABARAPL2 KO-Zellen, nach EGF-Stimulation eine zeitabhängige, schnellere Rezeptor-Degradation auf Proteinebene stattfindet und es zu Veränderungen hinsichtlich des mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalweges und der Ziel-Genexpression kommt. Ergänzend zu diesen Ergebnissen konnte innerhalb dieser Arbeit durch konfokale laser scanning microscopy (LSM) ebenfalls eine schnellere Internalisierung von fluoreszenzmarkierten EGF-gebundenem EGFR festgestellt werden. LSM Aufnahmen und deren Analyse ergaben eine hinsichtlich der Anzahl, Größe und Intensität zeitlich abhängige veränderte Vesikelzusammensetzung innerhalb der GABARAP-defizienten Zellen im Vergleich zu den Wildtyp (WT)-Zellen. Durch die durchgeführten IF-Färbungen der endosomalen Markerproteine ras-related in brain (Rab)5 (frühes Endosom), Rab7 (spätes Endosom) und Rab11 (Recycling-Endosom) und deren Analyse mittels diverser Kolokalisations-Auswertungsvarianten konnten insgesamt keine signifikanten Unterschiede zwischen den WT- und GABARAP KO-Zellen in Bezug auf die endosomalen Transportprozesse während des EGFR-Abbaus ausgemacht werden. Dies zeigt, dass der EGFR in den WT- und GABARAP KO-Zellen alle untersuchten Kompartimente durchlaufen kann. Mittels enhanced green fluorescent protein (EGFP)-GABARAP knock-in (KI)-Zellen, die einen EGFP-KI hinter dem endogenen GABARAP-Promotor (EGFP-KI GABARAP HEK293-Zellen) besitzen, wurde der Einfluss von GABARAP in Bezug auf die EGFR-Internalisierung weitergehend untersucht. Durch konfokale Lebendzell-Mikroskopie mittels LSM und spinning disk microscopy (SDM) waren innerhalb dieser Arbeit partielle Komigrationen von GABARAP mit EGF(R) ersichtlich, was auf eine mögliche direkte oder auch indirekte Interaktion dieser beiden Proteine miteinander hindeutet. Co-Immunopräzipitationsdaten von GFP-GABARAP mit endogenem EGFR sowie ein extended LC3-interacting region (xLIR)-Motiv innerhalb des EGFRs deuten auf eine mögliche direkte Bindung von GABARAP und dem EGFR hin. Zudem konnten durch Lebendzell-Mikroskopie ringförmige Vesikel mit membranständigem GABARAP, das teilweise mit fluoreszenzmarkiertem EGF und/oder Transferrin (Trf) kolokalisierte, beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass diese Strukturen an Recycling-Prozessen beteiligt sein könnten. Parallel wurde in dieser Arbeit ein Beitrag zu einer auf single-molecule localization microscopy (SMLM) basierenden Studie geleistet. Durch Expression von enhanced yellow fluorescent protein (EYFP)-GABARAP und EYFP-LC3B wurden GABARAP- und LC3B-enthaltende Strukturen in Bezug auf ihre Größe und Form untersucht. Dabei konnte durch SMLM im Vergleich zu konfokaler LSM eine weitaus höhere Auflösung erzielt werden. Die Klassifizierung nach Größe und Form zeigte, dass LC3 eher in einer U-Form und GABARAP vorwiegend in ringförmigen Strukturen vorliegt. In Zukunft können nun unter anderem mit Hilfe der neu etablierten Werkzeuge GABARAP-abhängige Funktionen und weitere mögliche GABARAP-Interaktionspartner genauer untersucht werden. Since the Nobel Prize was awarded in 2016 to Yoshinori Ohsumi for the discovery of AuTophaGy related (Atg) proteins in yeast, the human ATG8 protein family is in the focus of scientific research. The ATG8 family consists of the γ-aminobutyric acid A (GABAA) receptor-associated protein like-1/2 (GABARAP/-L1/-L2) and the microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3 (MAP1A/1B LC3) A, -B, -B2, -C subfamily, The ATG8 proteins are relevant for both autophagy dependent and autophagy independent processes in cells. In addition to the important tasks during autophagy, a dynamic process that represents a degradation and recycling pathway of cellular and non-cellular components, GABARAP was first described as a GABAA receptor associated protein that mediates the transport of the receptor to the plasma membrane. The ATG8 protein family is evolutionarily highly conserved and shows a high sequence and structural homology, especially within the respective subfamily. An exact differentiation of the functions of the individual ATG8 members on an endogenous level has so far hardly been possible due to a lack of methods and utensils for a targeted investigation. Therefore, the aim of this work was to establish tools for the differentiated investigation of the individual ATG8 members and subsequently to use them for the investigation of specific roles and functions, especially of the GABARAP proteins. First, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9) knockout (KO) plasmids were cloned and the KO cell lines were generated within our working group. Subsequently, an anti-GABARAP antibody was developed in cooperation with the Monoclonal Antibody Core Facility of the Helmholtz Zentrum München. Within this work, it was tested and validated using various KO cell lines. Immunofluorescence (IF) staining showed a high specificity for GABARAP without cross-reacting with LC3s and the closely related proteins GABARAPL1 and -L2. The GABARAP KO cell lines were also pioneering in the investigation of the influence of GABARAP deficiency in epidermal growth factor receptor (EGFR) endocytosis. Within our working group, it was shown that in GABARAP KO, but not in GABARAPL1 KO and GABARAPL2 KO cells, a time-dependent, faster receptor degradation takes place at the protein level after EGF stimulation, leading to changes in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway and target gene expression. In addition to these results, confocal laser scanning microscopy (LSM) was also used in this study to detect a faster internalization of fluorescence-labelled EGF-bound EGF receptors. Moreover, analysis of the LSM images revealed an altered vesicle composition regarding vesicle number, size and intensity in GABARAP-deficient cells compared to the wild-type (WT) cells over time. IF-staining of the endosomal marker proteins ras-related in brain (Rab)5 (early endosome), Rab7 (late endosome), and Rab11 (recycling endosome), and subsequent analysis with various co-localization evaluation methods revealed no significant differences between WT and GABARAP KO cells with regard to endosomal transport processes during EGF receptor degradation. This shows that in WT and GABARAP KO cells, EGFR can pass through all compartments investigated. Using enhanced green fluorescent protein (EGFP) knock-in (KI) cells, which possess an EGFP KI behind the endogenous GABARAP promoter, the influence of GABARAP on EGFR internalisation was further investigated. Confocal live cell microscopy using LSM and spinning disk microscopy (SDM) revealed partial co-migrations of GABARAP with EGF(R), indicating a possible direct or indirect interaction of these two proteins with each other. Co-immunoprecipitation data of GFP-GABARAP with endogenous EGFR and an extended LC3-interacting region (xLIR) motif within EGFR indicate a direct binding of GABARAP and EGFR. In addition, ring-like structures with membrane-bound GABARAP partially co-localizing with fluorescence-labelled EGF and/or transferrin (Trf) could be observed during live cell microscopy, suggesting that these structures might be associated with recycling. In parallel, this work was a contribution to a study based on single molecule localization microscopy (SMLM). By expression of enhanced yellow fluorescent protein (EYFP)-GABARAP and EYFP-LC3B, GABARAP and LC3B-containing structures were investigated with respect to their size and shape. By SMLM, a much higher resolution could be achieved compared to confocal LSM. Classification by size and shape showed that LC3 tends to be present in U-shaped and GABARAP predominantly in ring-shaped structures. In the future, the newly established tools will allow for a more detailed investigation of GABARAP-dependent functions and other possible GABARAP interaction partners.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	12.11.2020
Dateien geändert am:	12.11.2020
Promotionsantrag am:	16.07.2020
Datum der Promotion:	18.08.2020