Dokument: Biochemische Charakterisierung der Phospholipase PlaF aus Pseudomonas aeruginosa und ihres humanen Homologs ABHD6

Titel:	Biochemische Charakterisierung der Phospholipase PlaF aus Pseudomonas aeruginosa und ihres humanen Homologs ABHD6
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54677
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20201106-113918-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Strunk, Christoph Heinrich [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,01 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.11.2020 / geändert 05.11.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Gram-negative Bakterium P. aeruginosa ist ein opportunistisches Humanpathogen und ist an einer Vielzahl von krankenhausassoziierten Infektionen von immunsupprimierten Patienten beteiligt. Die WHO stufte P. aeruginosa in einer aktuellen Studie in die Risikogruppe 1, mit dringendem Handlungsbedarf in der Erforschung und Entwicklung von Antibiotika, ein. Eine entscheidende Eigenschaft für die Virulenz und Pathogenität des Bakteriums ist sein Arsenal an Virulenzfaktoren, welches die Invasion in die Wirtszelle oder eine erfolgreiche Interaktion mit der Wirtszelle ermög-licht. Auf Grund dessen erlangen diese Virulenzfaktoren immer größere Bedeutung in der Erforschung als alternative Angriffspunkte für Antibiotika. Das im Genom von P. aeruginosa vorgefundene Gen pa2949 kodiert für eine PLA1, die mit PlaF betitelt wurde und einen signifikanten Einfluss auf die Virulenz des Bakteriums aufweist. Mutagenitätsanalysen innerhalb der TM-Helix, JM-Region und der innerhalb von PlaF befindlichen Tunnel lieferten Daten zur Struktur-Funktionsbeziehung von PlaF. Somit zeigte sich besonders für die Variante V33A der TM-Helix ein Einfluss auf die Aktivität und gleichzeitig auf den oligomeren Zustand von PlaF. Für die Varianten der JM-Region konnte eine Beteiligung der Aminosäuren Ser29 und Thr32 an der Fettsäure-induzierten Dimerisierung gezeigt werden. Mit Hilfe von Mutanten innerhalb der Tunnel der PlaF-Struktur konnte der Substratzugangstunnel in das aktive Zentrum von PlaF identifiziert werden. Weiterhin konnte das lipolytische Profil von PlaF um natürliche Substrate erweitert werden. Hierzu gehört die Hydrolyse neutraler Lipide, den MAGs und DAGs, mit unterschiedlichen Fettsäure-Kettenlängen. Außerdem konnte Hydrolyseaktivität von struktur- und signalgebenden Lipiden wie BMP, HBMP, CL und DOPE für PlaF identifiziert werden. Diese Daten stützen die vermutete Beteiligung von PlaF in der Membranphospholipid-Homöostase oder als Modulator von FMMs. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Rekonstitution von PlaF in SUVs etabliert und erste Untersuchungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich eine Aktivierung von PlaF in einer Phospholipidumgebung im Vergleich zu Detergens-solubilisiertem PlaF. Des Weiteren wurden spezifisch die positiv-geladenen, organischen Reste innerhalb der Kopfgruppen von PC und PE gefunden, die unterschiedlich starke Phospholipid-aktivierende Effekte auf PlaF in SUVs lieferten. Für PG, mit einem neutralen, organischen Rest innerhalb der Phospholipidkopfgruppe, konnte hingegen kein aktivierender Effekt durch die Phospholipidumgebung detektiert werden. Zudem wurde PlaF in SUVs aus einem E. coli TLE rekonstituiert, um das Verhalten von PlaF in einer typischen Gram-negativen Membran nachzuempfinden. Auch das komplexe Zusammenspiel verschiedenster Lipide innerhalb dieser SUVs lieferte eine Aktivierung von PlaFSUV. Zusätzlich zum entdeckten Phospholipid-aktivierenden Effekt auf PlaF konnte eine verringerte Dimerisierung von PlaFSUV im Vergleich zu PlaFDDM ermittelt werden. Durch Sequenzhomologien konnte in vorausgegangen Arbeiten mit ABHD6 ein humanes Homolog zu PlaF aus P. aeruginosa mit einer Sequenzähnlichkeit von 49 % ermittelt werden. Dieses gehört, ebenso wie PlaF, zur Proteinfamilie der α,β-Hydrolasen und ist im intrazellulären Vesikeltransport, dem Energie- und Lipidmetabolismus sowie als Regulator im Endocannabinoid-Signalweg beteiligt. Während dieser Arbeit wurde anhand von biochemischen in vitro-Charakterisierungen und in vivo-Untersuchungen ein Vergleich von PlaF mit seinem Humanhomolog durchgeführt. Hierzu wurde zu Beginn eine heterologe Expression in E. coli BL21(DE3) und anschließende Reinigung von ABHD6 etabliert sowie die Membranlokalisierung bestätigt. Beim Vergleich der Enzymkinetik konnte für beide Proteine ein Michaelis-Menten-Verlauf mit einer Produktinhibierung detektiert werden. Auf Grund der beschriebenen Gemeinsamkeiten wurde innerhalb dieser Arbeit eine Plasmid-basierte Komplementierung des P. aeruginosa ΔplaF-Stammes vorgenommen und im Hinblick auf seine Biofilmproduktion und Schwimmbeweglichkeit des Bakteriums mit dem Wildtyp P. aeruginosa hin untersucht. Die im Deletionsstamm typische reduzierte Biofilmproduktion konnte durch ABHD6 nicht komplementiert werden. Die reduzierte Schwimmbeweglichkeit des Deletionsstammes konnte durch die Komplementierung mit ABHD6 wiederum in gewissem Ausmaß wiederhergestellt werden. Außerdem konnte in weiteren Versuchen ein überlappendes Substratprofil zwischen PlaFDDM und ABHD6DDM identifiziert werden. Ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Proteinen wurde durch eine nahezu ausbleibende Dimerisierung von ABHD6DDM im Gegensatz zu PlaFDDM detektiert. Um diesen Unterschied auch auf struktureller Ebene weiter zu erforschen, wurde in Kooperation mit dem Institut „Computational Pharmaceutical Chemistry and Molecular Bioinformatics“ der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf eine modellierte ABHD6-Struktur mit dem Programm Top-Model erstellt. Die Überlagerung beider Strukturen zeigte innerhalb der katalytischen Domäne einen RMSDall von 0,8 Å, wohingegen sich der N-terminale Bereich von ABHD6 drastisch von der TM-Region von PlaF unterschied. Beim Vergleich der Aktivitäten beider Proteine in SUVs konnte für ABHD6SUV ebenfalls ein Phospholipid-aktivierender Effekt identifiziert werden. Die Aktivitätssteigerungen lagen dabei bei ~ 1,9 (PlaFSUV) und ~ 3,5 (ABHD6SUV) im Vergleich zu ihren Detergens-solubilisierten Gegenstücken PlaFDDM und ABHD6DDM. The Gram-negative bacterium P. aeruginosa is a human pathogen, which is involved in a variety of hospital-associated infections of immunosuppressed patients. Recently, the WHO classified P. aeruginosa into the risk group 1, with an urgent need for action in the research and development of antibiotics. A decisive property for the virulence and pathogenicity of the bacterium is its arsenal of virulence factors, which enables the invasion into the host cell or a successful interaction with the host cell. Because of this, virulence factors are becoming increasingly important as alterna-tive targets for antibiotics. The gene pa2949 of P. aeruginosa encodes a phospholipase A1, which has been named PlaF and was shown to have a significant influence on the virulence of the bacterium. Mutational analysis within the TM helix, JM region and the tunnels within PlaFDDM, provided data on the structure-function relationship of PlaF. Especially for the mutant V33A of the TM-helix, an influence on the activity and at the same time on the oligomeric state of PlaFDDM was shown. Furthermore, the involvement of the amino acids Ser29 and Thr32 from the JM-region in the fatty acid-induced dimerization was suggested. Mutational analysis aimed to block the substrate binding tunnels of PlaFDDM, revealed tunnel 2 as the access tunnel for the substrate delivery. Furthermore, the lipolytic profile of PlaFDDM could be expanded to different natural substrates. This includes the hydrolysis of neutral lipids of MAGs and DAGs with different fatty acid chain lengths. Additionaly, hydrolase activity on structural and signaling lipids such as BMP, HBMP, CL and DOPE for PlaF were identified, too. These data support the postulated role of PlaF in membrane phospholipid homeostasis or as modulator of FMMs. Within this thesis, the reconstitution of PlaF in SUVs was established and first biochemical investigations were carried out. These results revealed an activation of PlaF in phospholipid vesicles in comparison to detergent-solubilized PlaF. Furthermore, the positively charged organic residues within the head groups of PC and PE containing SUVs could be identified specifically as activators of PlaF activity. For PG, with a neutral organic residue, no activating effect from the phospholipid environment could be detected. Furthermore, PlaF was reconstituted in SUVs comprised of an E. coli total lipid extract in order to investigate the behaviour of PlaF in a typical Gram-negative membrane. The complex interaction of different lipids within these SUVs also provides an activation of PlaF. In addition to the discovered phospholipid-activating effect on PlaF, a reduced dimerization of PlaFSUV compared to PlaFDDM could be determined. By sequence homology analysis, ABHD6 was identified as the human homolog of PlaF from P. aeruginosa with sequence similarity of 49 %. Like PlaF, it is a member of the α,β-hydrolase protein family and is involved in intracellular vesicle transport, energy- and lipid-metabolism and as a regulator in the endocannabinoid signaling pathway. In this thesis, a comparison of PlaF with ABHD6 was carried out on the basis of biochemical in vitro characterizations and in vivo investigations. For this, a procedure for heterologous expression in E. coli BL21(DE3) with subsequent purification of ABHD6 was established and its membrane localization was confirmed. While comparing the enzyme kinetics, a Michaelis-Menten kinetic with product inhibition could be detected for both proteins. Due to the similarities described, plasmid-based complementation of the P. aeruginosa ΔplaF mutant strain was carried out within this thesis and examined with regard to its biofilm production and swimming mobility of the bacterium with the wild type P. aeruginosa. The reduced biofilm production, which is typical of the P. aeruginosa ΔplaF strain, could not be complemented by abhd6 expression. The reduced swimming motility of the P. aeruginosa ΔplaF strain could partially be restored by complementing it with abhd6 expression. In addition, an overlapping substrate profile between PlaF and ABHD6 was identified in further experiments. A significant difference between the two proteins could be detected by an almost absent dimerization of ABHD6 in comparison to PlaF. To further investigate this difference on a structural level, a modeled ABHD6 structure was created with the program TopModel in cooperation with the institute "Computational Pharmaceutical Chemistry and Molecular Bioinformatics" (HHU Düsseldorf). The superposition of both structures showed an RMSDall of 0.8 Å within the catalytic domain, whereas the N-terminal region of ABHD6 differs drastically from the TM-region of PlaF. When comparing the activities of both proteins in SUVs, a phospholipid-activating effect could be identified for ABHD6SUV as well. The increase in activity was ~ 1.9 and ~ 3.5 for PlaFSUV and ABHD6SUV compared respectively to their detergent-solubilized counterparts PlaFDDM and ABHD6DDM.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	06.11.2020
Dateien geändert am:	06.11.2020
Promotionsantrag am:	12.05.2020
Datum der Promotion:	05.10.2020