Dokument: Regulation der Phosphatmangelgene von Corynebacterium glutamicum durch das Zweikomponenten-System PhoRS

Titel:	Regulation der Phosphatmangelgene von Corynebacterium glutamicum durch das Zweikomponenten-System PhoRS
Weiterer Titel:	Regulation of the phosphate starvation inducible genes of Corynebacterium glutamicum by the PhoRS two-component system
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5467
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070810-094545-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schaaf, Sarah [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,15 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.08.2007 / geändert 09.08.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Gram-positive Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum besitzt 13 Zwei-Komponenten-Signaltransduktionssysteme. Darunter befinden sich die Sensorkinase PhoS und der Antwortregulator PhoR, die bei der Phosphatmangelantwort eine zentrale Rolle spielen. Durch Transkriptomanalysen konnten die Phosphatmangelgene identifiziert werden. Ein Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Wechselwirkung des Transkriptionsregulators PhoR mit seinen Zielgenen. Mittels Gelretardationsexperimenten konnte die direkte Bindung von PhoR an die Promotorregion von 10 postulierten Zielgenen, u. a. pstSCAB (ABC-Transporter für Phosphat) und phoRS, nachgewiesen werden. Dabei deutet die Bindung von PhoR an seine eigene Promotorregion auf Autoregulation hin. Phosphorylierungsexperimente zeigten die für ein Zwei-Komponentensystem typische Autophosphorylierung der Sensorkinase und den effektiven Phosphorylgruppentransfer von der Sensorkinase auf den Antwortregulator. Gelretardationsexperimente mit unphosphoryliertem PhoR und PhoR~P zeigten, dass PhoR eine etwa 5-fach gesteigerte DNA-Bindungsaffinität durch die Phosphorylierung aufwies. Des Weiteren konnten unterschiedliche Bindungsaffinitäten von PhoR gegenüber den getesteten Promotorregionen nachgewiesen werden (pstS > phoR > phoC > ushA, porB > ugpA > pitA > nucH, phoH1 > glpQ1). Um ein Konsensusmotiv abzuleiten, wurden die PhoR-Bindestellen innerhalb der Pomotorregion von pstS und phoR eingegrenzt und durch Mutationsanalysen genauer untersucht. Das abgeleitete PhoR-Bindemotiv, bestehend aus einem für OmpR-Typ Regulatoren charakteristischen „direct repeat“, konnte durch Mutationsanalysen bestätigt werden. Hierbei konnte die beste Interaktion von PhoR~P mit dem optimierten 8 bp langen „direct repeat“ CCTGTGAAaatCCTGTGAA festgestellt werden. Die 8 bp langen Sequenzwiederholungen werden dabei durch 3 bp separiert. Darüber hinaus wurde exemplarisch die in vivo-Relevanz der PhoR-Bindestelle innerhalb der Promotorregion von phoR mittels Transkriptionsfusionsanalysen verifiziert. C. glutamicum ist für die industrielle Aminosäureproduktion, u. a. des Futtermitteladditivs L-Lysin, von großer Bedeutung. In dem zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher der Einfluss von Phosphatmangel und des PhoRS-Zweikomponenten-Systems auf die Lysinbildung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Produktivität von DM1730/pEKEx2 durch Kultivierung unter Phosphatmangel um etwa 12,5 % auf 0,045 ± 0,001 g Lysin•l-1•h-1 gegenüber der Kultivierung bei Phosphatüberschuss gesteigert wurde. Durch Überproduktion von PhoRS unter Phosphatüberschussbedingungen konnte sogar eine Produktivitätssteigerung von ca. 60 % auf 0,064 ± 0,003 g Lysin•l-1•h-1 gegenüber DM1730/pEKEx2 ohne IPTG bei Phosphatüberschuss erreicht werden. The Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum possesses 13 two-component signal transduction systems. Among these the membrane-bound sensor kinase PhoS and the response regulator PhoR are involved in the phosphate (Pi) starvation response. To analyse the binding of unphosphorylated and phosphorylated PhoR to the promoters of phosphate starvation-inducible (psi) genes, this response regulator and the kinase domain of its cognate sensor PhoS were overproduced and purified. The kinase domain showed constitutive autophosphorylation activity and a rapid phosphoryl group transfer from phosphorylated kinase domain to PhoR was observed. Gel mobility shift assays revealed that phosphorylation increases the DNA-binding affinity of PhoR about 5-fold. The affinity of PhoR~P to different promoters varied and decreased in the order pstSCAB > phoRS > phoC > ushA > porB > ugpA > pitA > nucH, phoH1 > glpQ1. The binding sites in front of pstSCAB and phoRS were localized at positions -194 to -176 and -61 to -43 upstream of the transcriptional start sites, respectively. Using mutational analysis these two 19-bp binding sites were analysed in detail and an alignment revealed a high identity in the 5’-terminal part, but not the 3’-terminal part. As many OmpR-type response regulators bind to direct repeats, the 19-bp sequence might be interpreted as a loosely conserved 8-bp direct repeat separated by three bp. This idea was supported by the fact that the highest binding affinity was observed with a perfect 8-bp direct repeat of the sequence CCTGTGAAaatCCTGTGAA. Inspection of the other target promoters revealed sequences with some similarity to this binding motif, which represent putative PhoR binding sites. The in vivo relevance of the PhoR-binding site within the phoRS promoter was supported by reporter gene studies. C. glutamicum is used industrially for the production of more than two million tons of amino acids per year, mainly L-glutamate and L-lysine. In the second part of this work the influence of phosphate limitation and the overproduction of the PhoRS-system on the lysine production of DM1730 were analysed. Interestingly, cultivation under phosphate limitation resulted in an increased productivity of DM1730/pEKEx2 of about 12,5 % to 0,045 ± 0,001 g lysine•l-1•h-1 compared to cultivation under phosphate excess. Overproduction of PhoRS under phosphate limitation even led to an increased productivity of about 60 % in comparison to DM1730/pEKEx2 cultivated under phosphate excess.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	09.08.2007
Dateien geändert am:	09.08.2007
Promotionsantrag am:	22.05.2007
Datum der Promotion:	26.06.2007