Dokument: Establishment of an Adverse Outcome Pathway-informed testing battery for predicting Parkinsonian Motor Deficits in vitro

Titel:	Establishment of an Adverse Outcome Pathway-informed testing battery for predicting Parkinsonian Motor Deficits in vitro
Weiterer Titel:	Etablierung einer Testbatterie mit Adverse Outcome Pathway-Informationen zur Vorhersage von Parkinson-Motordefiziten in vitro
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54646
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20201104-111139-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mr. Elgamal, Mohamed [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,77 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.11.2020 / geändert 03.11.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Fritsche, Ellen [Gutachter] PD Dr. med. Butz, Markus [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Parkinson-Krankheit (PD) ist die zweithäufigste neurodegenerative Krankheit im Alter und betrifft etwa 1% der über 60-jährigen Bevölkerung. Viele epidemiologische Studien und Tierstudien unterstützen die Hypothese, dass die Exposition gegenüber Pestiziden das Risiko an Parkinson zu erkranken erhöht. Allerdings sind die Ergebnisse dieser Studien nicht eindeutig. Daher empfiehlt die europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) den Einfluss von Pestiziden auf die Parkinson Krankheit durch Anwendung des ‚Adverse Outcome Pathway‘ (AOP) Konzepts erneut zu überprüfen. Basierend auf den Empfehlungen der EFSA, sollte in dieser Arbeit eine humane in vitro Batterie zur Gefahrenerkennung etablieren werden, welche auf den Wirkmechanismen (Mode-of-Action) der Parkinson Krankheit sowie auf den zugehörigen AOPs basiert. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden zwei Testsysteme zur Untersuchung dopaminerger Neurone (DNs) etabliert. Zum einen wurden DNs durch Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs) gewonnen. Zum anderen wurde eine humane Zellkultur aus dem Mesencephalon (LUHMES) verwendet. Mit letzterem Testsystem gelang die Etablierung verschiedener Assays, welche die Schlüsselereignisse (Key Events; KEs) der Parkinson-AOPs abbilden. Die Untersuchung dieser KEs basiert auf der Bestimmung der Zell Viabilität durch Messung der Reduktaseaktivität und der Adenosintriphosphat (ATP) Produktion, der Bestimmung der proteasomalen Aktivität, der Messung von Zytotoxizität, sowie der Identifizierung von Apoptose. Mit Hilfe von zwei Modelsubstanzen für Parkinson, Rotenon und Paraquat, konnte so eine Testbatterie basierend auf LUHMES Zellen etabliert werden. Zur Sicherstellung der Spezifität der Batterie wurden die Negativsubstanzen Saccharin und Diethylenglycol getestet. Des Weiteren wurde der konzentrations- und zeitabhängige Effekt der häufig verwendeten Organophosphat-Pestizide (Chlorpyrifos, Parathion, Malathion und Dichlorovos) sowie deren Oxon-Metabolite untersucht. Veränderungen des intrazellulären Metaboloms während der LUHMES Differenzierung und der Exposition mit Pestiziden wurden mit Hilfe der Kernspinresonanzspektroskopie bestimmt. Alle Organophosphat-Pestizide sowie deren Metabolite verursachten Zytotoxizität und reduzierten die Zell Viabilität. Dabei sind die Aktivitätsprofile von Chlorpyrifos und Parathion vergleichbar mit Rotenon, während die von Malathion und Dichlorovos vergleichbar mit Paraquat sind. Es wurden außerdem eindeutige metabolische Veränderungen durch die Differenzierung und die Exposition mit Pestiziden hervorgerufen, was den Mehrwert der Metabolomanalyse für die Gefahrenerkennung verdeutlicht. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass sich Substanzeffekte auf frühe KEs der Parkinson Krankheit in einer auf LUHMES Zellen basierenden Testbatterie identifizieren lassen. Jedoch müssen weiterführende Arbeiten zeigen, ob diese Effekte spezifisch für dopaminerge Neurone sind. Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder of the elderly affecting approximately 1% of the population older than 60 years old. Numerous epidemiological and animal studies have supported the hypothesis that exposure to pesticides can increase the risk for developing PD, however, the results of these studies are not conclusive. Therefore, the European Food Safety Authority (EFSA) recommended the reassessment of the hypothesis that some pesticides may cause Parkinsonian motor deficits (PMD) using the adverse outcome pathway (AOP) concept. Based on the recommendations of EFSA, this work aimed to establish an AOP-informed and mode-of-action-based human in vitro test battery for hazard identification. Therefore, two test systems were established to obtain dopaminergic neurons, i.e. differentiated human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and Lund human mesencephalic (LUHMES) cells. A test battery based on dopaminergic neurons differentiated from LUHMES cells was successfully established. This human cellular model was used to establish assays based on key events (KEs) of the proposed AOPs using two model compounds for PMD, rotenone and paraquat. Those KEs are represented by the assessment of cell viability based on reductase activity and adenosine triphosphate (ATP) production, proteasomal activity, cytotoxicity and apoptosis. In order to determine the specificity of this test battery, the negative compounds saccharin and diethylene glycol were tested. The concentration- and time-dependent effects of the commonly used organophosphate pesticides chlorpyrifos, parathion, malathion and dichlorvos, as well as their oxon metabolites were investigated using this test battery. Moreover, changes of the metabolome during neuronal differentiation and in response to pesticides on differentiated LUHMES cells were assessed. All organophosphate pesticides and their metabolites affect at least cytotoxicity and cell viability based on reductase activity and ATP levels in the test battery. Thereby, the activity profiles of chlorpyrifos and parathion are similar to that of rotenone, while the effects of malathion and dichlorvos resemble paraquat responses. Furthermore, clear metabolome changes were detected during the neuronal differentiation of LUHMES cells and after exposure to pesticides, which indicate the potential value of implementing this approach for the toxicological assessments in the future. Notably, LUHMES cells seem to be a suitable model to identify if a compound affects early KEs of the AOP leading to PMD. However, future work needs to shed light on the specificity of the effects for dopaminergic neurons.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » An-Institute » Institut für Umweltmedizinische Forschung (IUF) an der HHU
Dokument erstellt am:	04.11.2020
Dateien geändert am:	04.11.2020
Promotionsantrag am:	29.07.2020
Datum der Promotion:	28.10.2020