Dokument: Etablierung von Ustilago maydis für den Einsatz in der industriellen Biotechnologie: Abbau pektinreicher Biomasse und Optimierung der Produktion von Ustilaginsäure
| Titel: | Etablierung von Ustilago maydis für den Einsatz in der industriellen Biotechnologie: Abbau pektinreicher Biomasse und Optimierung der Produktion von Ustilaginsäure | |||||||
| Weiterer Titel: | Establishing Ustilago maydis for the use in the industrial biotechnology: Degradation of pectin rich biomass and optimizing the ustilagic acid production | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54464 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20201016-132252-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Stoffels, Peter [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Verwendung von pflanzlicher Biomasse für die Produktion von andernfalls ölbasierten
Chemikalien und Produkten ist eine der treibenden Kräfte einer nachhaltigen Bioökonomie. Vorteilhaft ist dafür die Verwendung von pflanzlichen Produktionsrückständen, da dadurch eine Konkurrenz mit Agrarflächen für die Produktion von Lebensmitteln vermieden wird. Eine Möglichkeit die pflanzliche Biomasse zu zersetzen und wertvolle Metabolite zu produzieren, ist die mikrobielle Umwandlung durch die Nutzung von effektiven fermentativen Mikroorganismen mit einem breiten Stoffwechselspektrum. Der Basidiomycet Ustilago maydis stellt einen vielversprechenden Kandidaten für die Etablierung eines solchen konsolidierten Prozesses dar. In dieser Arbeit wurde der Pilz durch genetische Modifikationen für die Nutzung in der Bioprozessierung in zwei separaten Arbeitspaketen angepasst: i) Etablierung des Abbaus pektinreicher Biomasse und ii) Optimierung der Ustilaginsäureproduktion. i) Als biotropher Pilz besitzt U. maydis ein unvollständiges, aber vielversprechendes Set pektinolytischer Enzyme. Diese intrinsischen CAZymes wurden in der Hefeform des Stammes AB33P5ΔR, der durch die Deletion von fünf Proteasen eine reduzierte proteolytische Aktivität aufweist, konstitutiv überexprimiert. Die pektinolytische Aktivität eines dieser Enzyme, einer intrinsischen Endo-Polygalakturonase, wurde durch heterologe Polygalakturonasen aus Biomasse-abbauenden Pilzen und Bakterien komplementiert. Der funktionelle Export bakterieller Enzyme wurde durch den Einsatz des unkonventionellen Sekretionsmechanismus ermöglicht. Kulturen CAZymes-exprimierender Stämme wurden sowohl in offline-, als auch online-Messungen analysiert. Durch einen Co-Fermentationsansatz konnte eine effektive Hydrolyse von Polygalakturonsäure und die komplette Verstoffwechselung der freigesetzten Galakturonsäure erzielt werden. ii) Als natürlich produziertes Sekundärmetabolit sekretiert U. maydis das Cellobioselipid Ustilaginsäure, welches oberflächenaktive und antimikrobielle Wirkung gegen Pilze und Bakterien zeigt. Dieses Biotensid wird neben Mannosylerythritollipiden (MELs) unter Stickstoffmangelbedingungen produziert. Um die Produktion zu optimieren, wurde die Herstellung eines entkoppelten Stammes ohne Stickstoffabhängigkeit und ohne unnötige Nebenprodukte angestrebt. Durch die Hochregulation des Gens für den Transkriptionsfaktor Rua1 wurde die Ustilaginsäuresynthese von der Stickstoffabhängigkeit entkoppelt. Der Produktionshintergrund wurde durch eine schrittweise Deletionsstrategie erstellt, in der sowohl die CRISPR-Cas9 Technik als auch homologe Rekombination verwendet wurden. Der optimierte Stamm zeigte keine Synthese von MELs oder Itakonsäure, jedoch erhöhte Mengen an Ustilaginsäure, die in Kulturen im Schüttelkolben- und Laborfermentermaßstab produziert werden konnten. Auf diese Weise konnten wichtige Schritte auf dem Weg zu einer ersten konsolidierten Bioprozessstrategie für die pektinbasierte Produktion von Glykolipiden mit U. maydis erfolgreich implementiert werden.Utilizing plant biomass to replace fossil-based chemicals and products is a strong driver of a sustainable bioeconomy. Optimally, waste side-streams are exploited since they are not competing with arable land that could be used for food production. One possibility is microbial conversion based on effective fermentation hosts with a broad metabolic spectrum to decompose the plant biomass to produce valuable compounds. One promising microorganism for consolidated bioprocessing is the basidiomycete fungus Ustilago maydis. In this work, two separate work packages were conducted to genetically modify and adapt the fungus towards use in bioprocessing: i) degradation of pectin-rich biomass and ii) optimization of ustilagic acid production. i) As a biotrophic fungus, U. maydis possesses a limited but promising set of pectinolytic enzymes. These intrinsic CAZymes were constitutively overexpressed in the yeast-like growth form of AB33P5ΔR, a stain lacking five harmful proteases and therefore showing reduced proteolytic activity. The activity of one of these, an intrinsic endo-polygalacturonase was complemented by strains expressing potent heterologous polygalacturonases from other biomass-degrading fungi and bacteria. For functional export of bacterial enzymes the unconventional secretion pathway was exploited. CAZymes expressing strains were cultivated and analysed in offline and online measurements. Importantly, a co-fermentation strategy led to effective hydrolysis of poly-galacturonic acid as well as total consumption of the liberated galacturonic acid. ii) As a naturally produced secondary metabolite U. maydis secretes ustilagic acid, a cellobiose lipid biosurfactant with antibacterial and antifungal properties. This biosurfactant is produced along with mannosyl erythritol lipids (MELs) when U. maydis is suffering from nitrogen starvation. To optimize production, a strategy for generation of an uncoupled strain without nitrogen dependency and lacking dispensible by-products was employed. By upregulating the gene for the transcription factor Rua1 in this background, ustilagic acid production was uncoupled from nitrogen dependency. The desired production background was generated in a step-by-step gene deletion series using both CrispR-Cas9 technology and homologous recombination. The optimized strain was deficient in MELs and itaconic acid production and accumulated high amounts of ustilagic acid in flask culture as well as lab scale fermentation. In summary, important steps towards first consolidated bioprocessing strategies for pectinderived production of glycolipids using U. maydis were successfully implemented. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.10.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.10.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 11.08.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 24.09.2020 |
