Dokument: Structural and Kinetic Insights into Membrane Protein Folding

Titel:	Structural and Kinetic Insights into Membrane Protein Folding
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54452
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20211028-081240-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Elter, Shantha Theresa [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,37 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.10.2020 / geändert 12.10.2020
Beitragende:	Dr. Etzkorn, Manuel [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	Membrane Proteins, Folding, Membrane Mimetics
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Wie kommen Membranproteine in Form? Wie falten sie sich in ihrer natürlichen Umgebung, um fehlerfrei zu funktionieren? Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung dieser Fragen, mithilfe von zellfreier Proteinexpression, kinetischer Analysen und NMR-Studien des 7-transmembranen (7-TM) α-helikalen Proteins Bacteriorhodopsin (bR) aus dem Archaebakterium Halobacterium salinarium. Durch seine 7 TM Struktur dient bR auch als Modellprotein für andere Proteine ähnlicher Struktur, wie z.B. der wichtigen Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). In dieser Arbeit wurde ein stabiles E. coli basiertes zellfreies Expressionssystem etabliert, das die Produktion von bacterioOpsin (bO) und anderen Proteinen ermöglicht. Das neu etablierte zellfreie Expressionssystem wurde zudem dazu verwendet einige bislang nicht zugängliche (Membran)Proteine herzustellen und biophysikalisch zu untersuchen. Zusätzlich können Isotopenmarkierungen (z.B. kombinatorisch und stereospezifisch Methyl-Leu) mithilfe des Systems effizient und kostengünstig realisiert werden. Durch eine partielle, sequentielle Resonanzzuordnung wurde eine weitere Charakterisierung des ungefalteten Zustands von bO in Natriumdodecylsulfat (SDS) erreicht. Dies wurde unter anderem durch kombinatorische Isotopenmarkierungen mithilfe des zellfreien Expressionssystems in Kombination mit verschiedenen 2D NMR-Experimenten ermöglicht. Weiterhin wurden die aminosäurespezifischen Interaktionen von bO mit SDS mithilfe von 3D TROSY NOESY und [15N-1H]-HSQC Experimenten genauer analysiert. Der gefaltete Zustand von bR wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) und NMR Spektroskopie untersucht. Die NMR Charakterisierung von bR und GPCRs in Amphipol Umgebung (APOL) zeigten, dass die Auflösung und Dispersion der Spektren in hohem Maße von der Partikelgröße und Homogenität der Proben abhängt, welche wiederum die Refolding-Eigenschaften beeinflusst. Experimente zur Optimierung der bR-Proben für NMR-Studien zeigten, dass stets ein Kompromiss zwischen spektraler Qualität und Refoldingeffizienz eingegangen werden muss. Für eine genauere Analyse wurde ein neuer absorptionsbasierter Assay im 384 well Format entwickelt, der ein umfassendes Screening verschiedener Faltungsbedingungen von bR ermöglichte. Die Kombination kinetischer Daten zu den wichtigsten Parametern der Faltung (z.B. bO-, APOL-, Liganden- und SDS Konzentration) mit den erhaltenen NMR-Daten zeigte, dass die Ratio von bO zu SDS sowie das Vorhandensein monomerer SDS Moleküle die Schlüsselfaktoren des Faltungsprozesses sind. Erstmalig konnten zudem auch Einblicke in den Faltungsprozess mittels Echtzeitaufgelösten-NMR-Messungen gewonnen werden, welche die schnelle Umwandlung in einen NMR verborgenen Zustand andeuten. How do membrane proteins get into shape? How do they fold in their natural environment to function without errors? The aim of this work was to find answers to these questions by using cell free protein expression, kinetic analysis and NMR studies of the 7-transmembrane (7 TM) α helical protein bacteriorhodopsin (bR) from the archaebacterium Halobacterium salinarium. Due to its 7-TM structure, bR also serves as a model protein for similarly structured proteins, like the important family of G protein-coupled receptors (GPCRs). In this work a stable, reliable E. coli-based cell-free expression system was established, enabling the production of bacterioOpsin (bO) and other proteins. In addition the established cell-free expression system was used for the production of previously inaccessible (membrane) proteins enabling a subsequent biophysical characterization. Furthermore, the system facilitates efficient and economic isotope labelling strategies, such as combinatorial- or stereospecific methyl Leu labelling. A characterization of the unfolded state of bO in sodium dodecyl sulfate (SDS) was achieved by partial, sequential resonance assignment. Assignments were enabled by combinatorial labelling through the cell-free expression system and the combination of various 2D NMR experiments. In addition, amino acid-specific interactions of bO with SDS were analyzed in greater detail with 3D TROSY NOESY and [15N-1H]-HSQC experiments. The folded state of bR was analyzed using Atomic Force Microscopy (AFM) and NMR spectroscopy. NMR characterization of bR and GPCRs in amphipol (APOL) environment showed that resolution and dispersion of acquired spectra highly depend on particle size and sample homogeneity, which in turn influences refolding properties. Experiments to optimize bR samples for NMR-studies showed, that a constant compromise must be made between spectral quality and refolding efficiency. For a more detailed analysis, a new absorption based assay in a 384 well format was developed, facilitating extensive screening of various folding conditions of bR. The Combination of kinetic data of the most important parameters for folding (such as bO , APOL , ligand and SDS concentration) with the acquired NMR data showed that the ratio of bO to SDS, as well as the presence of monomeric SDS molecules are key factors for the folding process. For the first time, insights into the folding process of bR via real time-resolved NMR measurements were obtained, indicating fast transitions into a NMR concealed state.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	Oktober 2013- Oktober 2020
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	28.10.2021
Dateien geändert am:	28.10.2021
Promotionsantrag am:	29.07.2020
Datum der Promotion:	02.10.2020