Dokument: Charakterisierung muriner kardialer Fibroblasten und epikardialer stromaler Zellen nach Herzinfarkt
| Titel: | Charakterisierung muriner kardialer Fibroblasten und epikardialer stromaler Zellen nach Herzinfarkt | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54314 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20201007-110738-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Owenier, Christoph [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Schrader, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. rer. nat. Scheller, Jürgen [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Der Myokardinfarkt führt zur Aktivierung kardialer Fibroblasten (aCF) und induziert gleichzeitig die Bildung multipotenter epikardialer stromaler Zellen (EpiSC) an der Herzoberfläche. Beide Zellpopulationen tragen nach Infarkt entscheidend zum Wundheilungsgeschehen bei, sind aber aufgrund ihrer ähnlichen entwicklungsgeschichtlichen Herkunft experimentell nur schwer voneinander zu trennen. Für den Heilungsverlauf nach Infarkt ist unter anderem die Konzentration extrazellulärer Nukleotide und deren Abbauprodukte, insbesondere das Adenosin, von Bedeutung.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten aCF und EpiSC charakterisiert und hinsichtlich ihrer zellulären Heterogenität sowie ihres extrazellulären Purinstoffwechsels untersucht werden. Dazu wurde ein neues Protokoll für die simultane Isolation von aCF und EpiSC aus dem infarzierten Mäuseherzen entwickelt. Dieses beruht auf dem enzymatischen Verdau isoliert perfundierter Herzen zur Gewinnung von aCF, bei gleichzeitiger Applikation milder Scherkräfte auf die Herzoberfläche zur Isolation der EpiSC. Die erfolgreiche Anreicherung der beiden Zellfraktionen wurde durch Überprüfung verschiedener Fibroblastenmarker, mesenchymaler Marker sowie epikardialer Marker mit Hilfe von Durchfluss-zytometrie, Immunfärbungen und qRT-PCR bestätigt. Kardiale Fibroblasten (CF) aus gesunden Herzen dienten als Kontrolle. Die methodischen Arbeiten bildeten die Grundlage für eine vergleichende Einzelzell-Transkriptomanalyse von CF, aCF und EpiSC. Dabei zeigte sich, dass die EpiSC-Population durch insgesamt 11 Zellcluster gekennzeichnet ist, in denen bekannte epikardiale Aktivierungsmarker (Wt-1, Sema3d, Aldh1a2, Tbx-18) sehr heterogen exprimiert wurden. Ein Teil der EpiSC-Population wies eine CF/aCF-ähnliche Gensignatur auf. Lineage tracing Versuche mit Wt1CreERT2RosatdTomato Tieren offenbarten jedoch, dass diese Cluster nicht durch Wt-1+-Progenitorzellen gebildet werden. Dies weist auf die Existenz weiterer Zellpopulationen im Herzen hin, die zum EpiSC-Pool nach Infarkt beitragen. Genexpressionsanalysen in Kombination mit funktionellen Daten erlaubten zudem einen umfassenden Einblick in den extrazellulären Purinstoffwechsel. Auffallendes Charakteristikum der drei Zell-populationen war die starke Expression von Enpp1/3 und die damit verbundene Fähigkeit zum Abbau von ATP zu AMP, das allerdings nicht weiter zu Adenosin hydrolysiert wurde. Es ist denkbar, dass das generierte AMP nach Infarkt durch CD73 auf umliegenden Immunzellen hydrolysiert wird, wodurch sich anti-inflammatorisch/fibrotisch-wirkendes Adenosin bildet. Als weiteres Charakteristikum von CF, aCF und EpiSC stellte sich die Expression früher kardialer Gene heraus, die entscheidende Rolle bei der Kardiomyogenese spielen und somit kardiogenes Potential der Zellen vermuten lassen. Das neu etablierte Isolationsprotokoll erlaubt die effiziente Separation von aCF und EpiSC und eignet sich dazu, das komplexe Zusammenspiel von Myokard und Epi-/Subepikard in den verschiedenen Wundheilungsphasen nach Infarkt zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit beschreibt das Ausmaß der zellulären Heterogenität von kardialen stromalen Zellen, schildert deren kardiogenes Potential und charakterisiert ihren extrazellulären Purinstoffwechsel. Die erhobenen Daten bilden eine Grundlage, das Infarktgeschehen besser zu verstehen und zukünftig neue Therapiemöglichkeiten zu entwickeln.Myocardial infarction (MI) leads to activation of cardiac fibroblasts (aCF) and induces the formation of multipotent epicardial stromal cells (EpiSC) at the heart surface. Both populations importantly participate in cardiac healing after MI, but are experimentally difficult to capture. The release of nucleotides and their extracellular conversion to adenosine play a tremendous role in tissue remodeling. Thus, the present study aimed to characterize the aCF and EpiSC populations in detail and to study their cellular composition and extracellular purine metabolism. As part of this work, a fast and efficient protocol for the simultaneous isolation and characterization of aCF and EpiSC from the infarcted mouse heart was developed. For the isolation of aCF, infarcted hearts were digested by perfusion with a collagenase-solution for only 8 min, while EpiSC were enzymatically removed from the heart surface by applying a mild shear force. Cardiac fibroblasts (CF) isolated from unstressed hearts were used as a control. The sucessful cell-enrichment was confirmed by flow cytometry, immunostaining and qRT-PCR. Combination of scRNAseq and RNA in situ hybridization revealed new insights into the cellular composition of EpiSC and demonstrated that the post-MI epi-/subepicardium represents a highly heterogeneous cell compartment. In total, 11 individual EpiSC subpopulations were identified, which showed distinct expression patterns of the well-established epicardial progenitor markers (Wt-1, Tbx-18, Sema3d, Aldh1a2). Note, that a subset of the EpiSC population exhibited a CF/aCF-like gene signature, which was not derived from Wt-1+-cells suggesting that the total EpiSC-pool post MI is derived from different cellular sources. Gene expression analysis provided a comprehensive overview of the extracellular purine metabolism of CF, aCF and EpiSC. A main feature of the three stromal cell populations was the high expression of Enpp1/3, which was associated with the breakdown of ATP into AMP with only minor production of Adenosine This supports the hypothesis that AMP generated by stromal cells may serve as a substrate for CD73 on immune cells to produce anti-inflammatory/-fibrotic adenosine. Intriguingly, qRT-PCR analysis exhibited the expression of cardiogenic genes (Mef2c, Gata4, Tbx-5 und Hand2) in all three fractions, offering a new perspective to regenerative therapies. The newly established isolation protocol is well-suited for the efficient separation of aCF and EpiSC and provides a great tool for further comparative studies on their physiology and their possible interplay during cardiac healing. In summary, the better understanding of the epicardial cellular constituents, the identified enrichment of cardiogenic genes and the comprehensive analysis of the purine metabolism of the cardiac stromal cell populations may unleash novel treatment options to improve cardiac repair in near future. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Molekulare Medizin | |||||||
| Dokument erstellt am: | 07.10.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 07.10.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 12.05.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 07.09.2020 |
