Dokument: Understanding Metal-Mediated Catalysis - Structural and Functional Analysis of an RNA-Cleaving DNAzyme and Fe-S Cluster Containing Proteins
| Titel: | Understanding Metal-Mediated Catalysis - Structural and Functional Analysis of an RNA-Cleaving DNAzyme and Fe-S Cluster Containing Proteins | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54265 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20211006-091820-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Rosenbach, Hannah [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Jun.-Prof. Dr. Span, Ingrid [Gutachter] Prof. Dr. Gilch, Peter [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | The present thesis deals with the metal-dependent reactivity of biomolecules and is divided into two chapters.
The first chapter deals with the magnesium-dependent, artificial 10-23 Deoxyribozyme (DNAzyme), a single-stranded DNA molecule that catalyzes the cleavage of RNA strands. The DNAzyme consists of a catalytic core that is flanked by two substrate recognition arms that are capable of forming double helices with RNA substrates. In the presence of magnesium or manganese ions, the DNAzyme binds its specific RNA substrate and hydrolyzes the RNA between two nucleotides at the cleavage site, then the RNA products dissociate. Although the 10-23 DNAzyme has been isolated during in vitro selection processes more than 20 years ago, the mechanism by which the DNAzyme catalyzes the cleavage reaction is still unknown, due to the lack of high-resolution structural data. Collection of such information would provide the basis to obtain a deeper understanding of the function of these biocatalysts and to reveal the mechanism by which the DNAzyme performs the RNA cleavage. As a review, article 1 provides an overview on the actual state of research with regard to structure, function and metal ion dependency of the 10-23 DNAzyme. For this purpose, all modifications (mutations and deletions) at different positions within the DNAzyme sequence are systematically summarized. Additionally, the effects of different metal ions on the DNAzyme activity are compiled. The critical analysis of the data with regard to the conditions under which the reactions have been performed provide new insights for future attempts to solve the structure of the 10-23 DNAzyme. In article 2 the influence of different mono- and divalent metal ions (sodium, potassium, magnesium and manganese) on the reaction rates of RNA hydrolysis performed by the 10-23 DNAzyme is analyzed. Using FRET-based activity assays, isothermal titration calorimetry (ITC) measurements, as well as nuclear magnetic resonance (NMR) and electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy it was shown that monovalent cations influence the binding properties of magnesium and manganese ions to the DNAzyme:RNA complex in different ways: In the presence of potassium and sodium ions, the speed of the magnesium-mediated cleavage reaction is reduced, while the speed of the manganese-mediated reaction is enhanced. The different correlations suggest that the mechanism of the cleavage reaction is different for both divalent metal ions. While magnesium and sodium ions compete for the same binding site within the DNAzyme:RNA complex, manganese ions bind to a sodium-favored structure of the DNAzym:RNA complex. Our spectroscopic analysis allow for deep insights into the dynamic association of metal ions with the DNAzyme. Structure elucidation of nucleic acids using X-ray crystallography is highly challenging due to the negatively charged and regularly ordered phosphate backbone, which often leads to the formation of crystals with a poor long-range order. Additionally, the phasing is a major hurdle. Article 3 deals with the establishment of a new and efficient protocol for the crystallization of nucleic acids using the human RNA-binding protein U1A that has been previously used as a crystallization helper for the crystallization of nucleic acids. In this article, three crystal structures of U1A variants are presented that in contrast to the commonly used U1A sequence host a tryptophan residue. These U1A variants do not only expand the repertoire of crystallization modules, they also allow for an easy distinction between salt and protein crystals due to their intrinsic tryptophan fluorescence. Analyses of a ternary complex consisting of U1A protein, 10-23 DNAzyme, and RNA substrate using small angle X-ray scattering (SAXS) and NMR spectroscopy reveal that the U1A protein does not influence the structure of the catalytic core of the 10-23 DNAzyme and that therefore, the U1A protein has a high potential for structure elucidation of the ternary complex. In addition, a fast and efficient protocol for the production of protein-RNA crystals has been established. Here, pre-formed U1A protein crystals are incubated with RNA molecules that form a complex with the protein crystals. This binding can be visualized by fluorescence-based methods in crystallo. Article 4 presents different strategies for the crystallization of the 10-23 DNAzyme in complex with its RNA substrate, which all aim at solving the structure of the DNA:RNA complex in a catalytically relevant conformation. Here, co-crystallization of the DNAzyme:RNA complex with the RNA-binding protein U1A as a crystallization helper, as well as combinatorial crystallization experiments with a binary complex consisting of DNAzyme and RNA substrate with varying length were most promising. The second chapter of this thesis deals with the spectroscopic analysis of different iron-sulfur proteins. Article 5 describes the systematic analysis of the impact of different expression systems on the expression level, protein yield and the occupancy with Fe-S cluster. The biosynthesis of the Fe-S proteins was then compared to the production of the holo protein using chemical and semi-enzymatic reconstitution. Our data reveal that the use of specific expression systems enhances both protein yield as well as the specificity of the cluster incorporation. Furthermore, it was shown that no general-purpose system exists that provides the best results for every protein. The knowledge from these systematical studies on three well characterized [4Fe-4S] cluster have then been transferred to the production of the radical SAM enzyme ThnB, which has previously only been matured using chemical reconstitution. Article 6 deals with the pyrophosphatase domain of the bifunctional enzyme Asp1 from S. pombe. This protein belongs to the highly conserved family of the diphosphoinositol-pentakisphosphate kinasen PPIP5K/Vip1. The capability of the protein to bind a [2Fe-2S] cluster has recently been reported. However, the biological relevance of the cluster is still under debate. In this thesis, the phosphatase domain of Asp1 was isolated with a [2Fe-2S] cluster from an E. coli strain that is especially modified for the production of Fe-S cluster proteins. Using different spectroscopic methods, it was shown that the [2Fe-2S] cluster is coordinated by four cysteine residues at the position 607, 663, 864, and 879. Our data suggest that the Fe-S cluster is sensitive towards oxygen and that it is most likely not involved in redox reactions. In contrast to a previous study using aerobically isolated and chemically reconstituted Asp1, using in vivo and in vitro experiments we could show that the [2Fe-2S] cluster does not influence the pyrophosphatase activity of the protein. Our results point towards an additional biologically relevant function of the domain that is regulated by the presence of [2Fe-2S] cluster.Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der metallabhängigen Reaktivität von Biomolekülen und besteht aus zwei Kapiteln. Das erste Kapitel befasst sich mit dem Magnesium-abhängigen, artifiziellen 10-23 Desoxyribozym (DNAzym), einem einzelsträngigen DNA-Molekül, welches die Spaltung von RNA-Strängen katalysiert. DNAzyme bestehen aus einem katalytischen Kern und zwei flankierenden Erkennungssequenzen, die mit dem RNA-Substrat Doppelstränge ausbilden. In Anwesenheit von divalenten Kationen wie Magnesium- oder Mangan-Ionen können sie an ein spezifisches RNA-Substrat binden und dieses hydrolysieren, woraufhin die RNA-Produkte anschließend dissoziieren. Obwohl das 10-23 DNAzym bereits vor über zwei Jahrzehnten mittels in vitro-Selektion isoliert wurde, ist der Mechanismus, mit dem das DNAzym die Spaltung katalysiert, weitestgehend unbekannt. Der Grund hierfür liegt im Fehlen hochauflösender, struktureller Daten. Die Sammlung solcher strukturellen Daten auf atomarer Ebene würde die Grundlage schaffen, um die Funktionsweise dieser Biokatalysatoren zu verstehen und den Mechanismus der Reaktion aufzuklären. Artikel eins bietet in Form eines Reviews Einblicke in den Stand der Forschung im Hinblick auf Struktur, Funktion und Metallabhängigkeit des 10-23 DNAzyms. Hierbei werden alle Modifikationen (Mutationen und Deletionen) an unterschiedlichen Positionen im DNAzym systematisch zusammengefasst. Weiterhin werden die Effekte unterschiedlicher Metallionen auf die DNAzym-Kinetik zusammengefasst. Die kritische Analyse dieser Daten unter Berücksichtigung der Reaktionsbedingungen liefert neue Erkenntnisse für zukünftige Ansätze zur Strukturaufklärung des 10-23 DNAzyms. In Artikel zwei wird der Einfluss unterschiedlicher mono- und divalenter Metallionen auf die Reaktionsgeschwindigkeit der RNA-Hydrolyse, die durch das 10-23 DNAzym katalysiert wird, untersucht. Mithilfe FRET-basierter Aktivitätsmessungen, ITC-Messungen sowie NMR- und EPR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass monovalente Kationen das Bindungsverhalten von Magnesium- und Mangan-Ionen an den DNAzym:RNA Komplex unterschiedlich beeinflussen: In Anwesenheit von steigenden Konzentrationen an Kalium- und Natrium-Ionen wird die Magnesium-vermittelte Spaltung verlangsamt, während die Mangan-vermittelte Reaktion beschleunigt wird. Die unterschiedlichen Korrelationen deuten darauf hin, dass der Mechanismus der Katalyse in Anwesenheit von Magnesium- und Mangan-Ionen unterschiedlich ist. Während Magnesium- und Natrium-Ionen um die jeweiligen Bindungsstellen konkurrieren, wird die Bindung von Mangan-Ionen an den DNAzym:RNA Komplex durch die Natrium-Ionen unterstützt. Unsere spektroskopischen Messungen geben detaillierte Einblicke in die dynamische Assoziation der Metallionen mit dem DNAzym. Die Strukturaufklärung von Nukleinsäuren mittels Röntgenstrukturanalyse stellt eine große Herausforderung dar. Zum einen wird die Oberfläche von DNA- und RNA-Molekülen durch negativ geladene Phosphatgruppen dominiert, was häufig zu Kristallen mit einer geringen Fernordnung führt. Zum anderen stellt das Phasenproblem eine weitere große Hürde dar. Artikel drei befasst sich daher mit der Etablierung eines neuen und effizienten Protokolls für die Kristallisation von Nukleinsäuren mit Hilfe des bereits häufig als Kristallisationshelfer genutzten humanen RNA-bindenden Proteins U1A. Der Artikel präsentiert Kristallstrukturen von drei U1A-Varianten, die im Gegensatz zur herkömmlich genutzten Sequenz ein Tryptophan enthalten. Diese U1A-Varianten erweitern nicht nur das Repertoire an Kristallisationshelfern, sondern ermöglichen zusätzlich eine einfache Unterscheidung zwischen Protein- und Salzkristallen mittels Detektion der intrinsichen Fluoreszenz von Tryptophan. Untersuchungen eines ternären Komplexes aus U1A, 10-23 DNAzym und RNA-Substrat mittels NMR-Spektroskopie und Kleinwinkelröntgenstreuung zeigen, dass das U1A-Protein keinen Einfluss auf die Struktur des katalytischen Zentrums des 10-23 DNAzyms hat und somit hohes Potenzial als Kristallisationshelfer für die Strukturaufklärung des ternären Komplexes besitzt. Zusätzlich konnte ein schnelles und effizientes Protokoll zur Herstellung von Protein-RNA-Kristallen etabliert werden. Hierbei werden U1A-Protein-Kristalle mit RNA-Molekülen inkubiert. Diese bilden mit dem vorgeformten Proteinkristall einen Komplex aus, welcher dann über fluoreszenz-basierte Methoden die Detektion der RNA-Bindung in crystallo ermöglicht. In Artikel vier werden unterschiedliche Strategien zur Kristallisation des 10-23 DNAzyms im Komplex mit seinem RNA-Substrat vorgestellt, die alle darauf abzielen, die Struktur des DNAzym:RNA-Komplexes in einer katalytisch relevanten Konformation aufzuklären. Hier erwiesen sich vor allem die Co-Kristallisation des DNAzym:RNA-Komplexes mit dem RNA-bindenden Protein U1A als Kristallisationshelfer, als auch kombinatorische Kristallisationsexperimente mit binären Komplexen aus DNAzymen und RNA-Substraten unterschiedlicher Länge als besonders vielversprechend. Das zweite Kapitel der vorliegenden Dissertation befasst sich mit der spektroskopischen Untersuchung von verschiedenen Eisen-Schwefel-Proteinen. Artikel fünf beschreibt die systematische Untersuchung der Auswirkungen unterschiedlicher Expressionssysteme auf Expressionslevel, Proteinausbeuten und den Gehalt an Fe-S-Zentren im Protein. Die Biosynthese der Fe-S-Proteine wurde anschließend mit der Herstellung der Holoproteine durch chemische oder semi-enzymatische Rekonstitution verglichen. Unsere Daten zeigen, dass die spezifischen Expressionssysteme sowohl die Proteinausbeute als auch die Spezifität des Einbaus verbessern. Zudem zeigte sich, dass nicht ein einziges System für alle Zielproteine die besten Resultate lieferte. Die neuen Erkenntnisse aus den Studien drei etablierter [4Fe-4S]-Proteine konnten dann auf das Radikal-SAM-Enzym ThnB angewendet werden, welches bislang nur durch chemische Rekonstitution maturiert wurde. Artikel sechs befasst sich mit der Pyrophosphatase-Domäne des bifunktionalen Enzyms Asp1 aus Schizosaccharomyces pombe. Das Asp1-Protein gehört zu der hoch konservierten Familie der Diphosphoinositol-Pentakisphosphat-Kinasen PPIP5K/Vip1. Die Fähigkeit des Proteins ein [2Fe-2S]-Zentrum zu binden, wurde erst kürzlich entdeckt und die biologische Relevanz des Zentrums wurde bislang noch nicht aufgeklärt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Protein nach rekombinanter Herstellung in einem speziell für die Produktion von Fe-S-haltigen Proteinen optimierten Escherichia-coli-Expressionsstamms mit einem [2Fe-2S]-Zentrum isoliert werden kann. Mittels verschiedener spektroskopischer Techniken konnte gezeigt werden, dass das [2Fe-2S]-Zentrum von vier Cystein-Liganden an den Positionen 607, 663, 864 und 879 in der Aminosäuresequenz koordiniert wird. Unsere Daten deuten darauf hin, dass das Fe-S-Zentrum O2-empfindlich und höchstwahrscheinlich nicht an Redox-Reaktionen beteiligt ist. Im Gegensatz zu vorangegangenen Studien an einer aerob isolierten und chemisch rekonstituierten Proteinprobe konnte mithilfe von in-vivo- und in-vitro-Experimenten gezeigt werden, dass das [2Fe-2S]-Zentrum keinen Einfluss auf die Pyrophosphatase-Aktivität hat. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Pyrophosphatase-Domäne von Asp1 eine weitere biologische Funktion aufweist, die durch die Anwesenheit eines [2Fe-2S]-Zentrums reguliert wird. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 06.10.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 06.10.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 09.07.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.08.2020 |
