Dokument: Molekularbiologische und biochemische Analysen zur Charakterisierung der Funktion von CC2D1-Proteinen
| Titel: | Molekularbiologische und biochemische Analysen zur Charakterisierung der Funktion von CC2D1-Proteinen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54231 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20200917-110501-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Ruhnau, Kristina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die CC2D1-Proteinfamilie ist in allen Metazoen hoch konserviert. In Säugern kommen zwei Vertreter dieser Familie vor. Beide Proteine sind an der Regulation diverser Prozesse beteiligt,
wobei sich die Mehrheit der beschriebenen Funktionen auf CC2D1A bezieht. Dieses Protein spielt eine entwicklungsrelevante Rolle und sein Verlust in Mäusen ist postnatal letal. Obwohl die Cc2d1b-Defizienz keinen Einfluss auf die Vitalität von Mäusen hat, resultiert der Ausfall beider Proteine in der pränatalen Letalität. Ähnlich wie bei Säugern, ist der Lgd-Verlust in D. melanogaster letal. Diese Tiere sterben im frühen Puppenstadium infolge einer Störung im endosomalen Transportweg, die auf der fehlenden Interaktion zwischen Lgd und dem ESCRT Protein Shrub beruht. Basierend auf Zellkulturexperimenten konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass beide CC2D1-Proteine aus Säugern an der Regulation des endosomalen Transportwegs beteiligt sind. Eine Kombination aus immunzytochemischer Analyse und ultrastruktureller Charakterisierung der endozytotischen Vesikel in MEFs zeigt, dass der Verlust der CC2D1-Proteine zu milden Störungen in diesem Prozess führt. Beispielsweise, kommt es in Cc2d1a und Cc2d1b-einzel-defizienten sowie in DKO-MEFs zur Änderung der Morphologie und Größe der Endolysosomen. Mittels der Analyse der Nrarp-Expression konnte gezeigt werden, dass die Aktivität des Notch-Signalwegs in MEFs höchstwahrscheinlich in Korrelation zum endosomalen Phänotyp steht und nach dem Verlust beider CC2D1-Proteine erhöht ist. Außerdem hat eine Zellkernanalyse ergeben, dass die Interaktion der CC2D1-Proteine mit den ESCRT-Mitgliedern neben dem endosomalen Transportweg die ESCRT-vermittelte Neuassemblierung der Kernhülle beeinflusst. Der CC2D1B-Verlust ist mit einer Änderung der CHMP7-Lokalisation und einem Anstieg an Zellen mit defekten Zellkernen assoziiert. Trotz identifizierter Abnormalitäten scheint CC2D1B eine akzessorische Funktion in der Aufrechterhaltung der nukleären Integrität zu haben. Aufgrund des in DKO-MEFs beobachteten Phänotyps scheinen CC2D1-Proteine trotz starker Homologie keine redundante Funktion in diesem Prozess zu haben. Um eine mögliche Funktion von CC2D1B in den ESCRT-vermittelten Ereignissen aufzuklären, wurden biochemische Analysen durchgeführt. Basierend auf in vitro Experimenten unter der Verwendung der hoch gereinigten vollständigen Proteine konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass CHMP4B seinen konformationellen Zustand ändern kann. In Lösung präferiert CHMP4B die geschlossene Konformation, wobei ein signifikanter Anteil des Proteins ebenfalls in der offenen Form vorliegt. Seine Konformation wird durch die Wechselwirkung mit CC2D1B nicht beeinflusst. CC2D1B wird höchstwahrscheinlich benötigt, um an die offene Fraktion von CHMP4B zu binden und durch die Neutralisation des negativen Bereichs die unkontrollierte Polymerisation von CHMP4B im Zytosol zu unterbinden.The CC2D1 protein family is highly conserved in all metazoa. In mammals, two members of this family are present. Both proteins are involved in the regulation of a variety of processes, but the majority of described functions are related to CC2D1A. This protein plays a developmental role and its loss in mice is lethal postnatally. Although Cc2d1b deficiency has no influence on the viability of the mice, the lack of both proteins results in prenatal lethality. Like in mammals, the loss of Lgd in D. melanogaster is also lethal. These animals die at early pupal stage as a consequence of a disturbance in the endosomal pathway caused by the loss of interaction between Lgd and the ESCRT protein Shrub. Based on cell culture experiments performed in this study it was shown that both mammalian CC2D1 proteins are involved in the regulation of the endosomal pathway. A combination of immunocytochemical analysis and ultrastructural characterization of the endocytic vesicles in MEFs shows, that the loss of CC2D1 proteins leads to mild disturbances in this process. For instance, there is a change in morphology and size of the endolysosomes present in Cc2d1a and Cc2d1b-single deficient and DKO-MEFs. It could be shown through analysis of the Nrarp expression, that the activity of the Notch signaling in MEFs is most likely correlated to the endosomal phenotype and is increased upon the loss of both CC2D1 proteins. The nuclear analysis additionally demonstrated that the interaction of CC2D1 proteins with the ESCRT-member, besides the endosomal pathway, also influences the ESCRT-mediated reassembly of the nuclear envelope. The loss of CC2D1B is associated with a change of the CHMP7-localization and an increase in cells with defect cell nuclei. Despite the described abnormalities, CC2D1B seems to have an accessory function in the maintenance of nuclear integrity. Based on the phenotype observed in DKO-MEFs, CC2D1 proteins seem to have no functional redundancy in this process despite their strong homology. Biochemical analysis was performed to reveal a possible function of CC2D1B in ESCRT-mediated events. Based on in vitro experiments using highly purified full length proteins, it could be demonstrated for the first time, that CHMP4B is able to change its conformational state. In solution CHMP4B prefers a closed conformation, but a significant portion of the open form is also present. Its conformation is not affected by the interaction with CC2D1B. CC2D1B is most likely needed to bind to the open fraction of CHMP4B and to prevent uncontrolled polymerization of CHMP4B in the cytosol by neutralizing its negative part. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 17.09.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 17.09.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 26.05.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.07.2020 |
