Dokument: Novel carboxylic ester hydrolases from marine hydrocarbonoclastic bacteria - insights into organic solvent tolerance, substrate promiscuity and polyester hydrolysis

Titel:	Novel carboxylic ester hydrolases from marine hydrocarbonoclastic bacteria - insights into organic solvent tolerance, substrate promiscuity and polyester hydrolysis
Weiterer Titel:	Neue Carboxylester-Hydrolasen aus marinen hydrocarbonoclastischen Bakterien - Einblicke in die Lösungsmittletoleranz, Substratpromiskuität und Hydrolyse von Polyestern
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54116
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200907-095801-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bollinger, Alexander [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 71,08 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.09.2020 / geändert 03.09.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	marine bacteria, enzyme, hydrolase, esterase, lipase, organic solvent, substrate promuscuity, polyester hydrolysis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Biotechnological application of enzymes is an important tool for the transformation of chemical processes toward a bio-based economy. Therefore, the number of newly identified enzymes is growing each year, however this is not appropriately reflected by their industrial application. The low number of enzymes used in industrial processes compared to the available number of enzyme sequences is mainly due to insufficient characterization and performance of the biocatalysts under process conditions. Particular bottlenecks for the effective and efficient application of enzymes are for example (I) insufficient stability of the biocatalysts under process conditions, which often means in the presence of organic solvents, (II) a narrow range of use due to high substrate specificity, and (III) no activity with synthetic polymeric substrates. To cope with these challenges not only the identification of candidate enzymes but the molecular characterization for respective features is needed. In this thesis, the portfolio of available biocatalysts of the carboxylic ester hydrolase family was broadened by the identification of 25 enzymes (CE02 to CE26), most of them completely new, from two marine hydrocarbonoclastic bacteria, Alcanivorax borkumensis SK2, and Pseudomonas aestusnigri VGXO14. These enzymes were systematically assayed for relevant characteristics: substrate promiscuity, organic solvent tolerance, and hydrolysis of synthetic polyester substrates. For each characteristic, at least one outstanding example was found, and the molecular mechanism of the respective feature was investigated. The highest substrate promiscuity was found for CE07 from A. borkumensis. In a comparative analysis of more than 100 diverse ester hydrolases, CE07 ranked among the 10 most substrate promiscuous enzymes. Furthermore, the enzyme accepts complex water-insoluble esters as common in pharmaceutical biotechnology. Interestingly, whereas prominent substrate promiscuity was found to be negatively correlated with enantioselectivity for most carboxylic ester hydrolases, this is not true for CE07, which is selective for two out of ten chiral esters. Molecular docking computation with a homology model of CE07 and (R/S)-Menthyl acetate as ligand suggests, that the observed selectivity is rather based on differences in the catalytic rate of the reaction than on preferred binding of one enantiomer. To assess the organic solvent tolerance, a novel assay was devised and established which allowed to determine this characteristic directly from whole cell lysate, facilitating high throughput enzyme characterization. This way, the novel biocatalyst CE13 from P. aestusnigri was identified to be highly organic solvent tolerant, retaining substantial activity after incubation in 80 % acetonitrile for several hours. The molecular basis of the organic solvent tolerance of CE13 is connected to a large number of charged amino acid residues and stabilizing disulfide bridges, whereas it is not associated with high thermal stability. Furthermore, a screening strategy to identify polyester hydrolytic enzymes was established using the anionic aliphatic polyester-polyurethane Impranil DLN as a substrate. Of all enzymes tested, one biocatalyst originating from P. aestusnigri (CE16, also named PE-H) was found to show distinct polyester hydrolytic activity. Moreover, biochemical characterization of CE16 revealed evidence for amorphous PET film hydrolysis at 30 °C, which was improved by rational mutagenesis to allow activity with PET from a commercial single use bottle. The crystal structure of CE16 and of the improved variant was solved at high resolution (1.09 Å and 1.35 Å respectively) representing the first crystal structure of a type IIa PET hydrolytic enzyme. The enzyme structures were subsequently used to rationalize the enhanced activity by a more accessible active site and suggest the molecular mechanism of polymer binding by molecular docking computations. With the knowledge gained on substrate promiscuity, organic solvent tolerance and polyester hydrolysis, the possibility to combine multiple features in a single biocatalyst was evaluated. While substrate promiscuity and organic solvent tolerance were found to complement well, molecular mechanisms for polyester hydrolysis, like a surface exposed and flexible active site, appear contradicting to substrate promiscuity and organic solvent tolerance. Hence, one biocatalyst to comply with all demands remains utopic, but an approximation to this future biocatalyst is conceivable. In conclusion, the presented thesis took part in deepening the understanding of highly important molecular characteristics for industrial application of biocatalysts, gave rise to a set of new and comprehensively characterized carboxylic ester hydrolases, and provided hints for the design of a next generation biocatalyst, which combines most of the respective features. Die biotechnologische Anwendung von Enzymen ist ein wichtiges Werkzeug für den Wandel von klassischen chemischen Prozessen hin zu einer bio-basierten Ökonomie. In Folge dessen nimmt die Zahl der jährlich neuentdeckten Enzyme stetig zu, was jedoch nicht direkt durch eine im gleichen Maße gesteigerte industrielle Anwendung wiedergespiegelt wird. Die geringe Anzahl der industriell genutzten Enzyme im Vergleich zu der hohen Anzahl an verfügbaren Enzymsequenzen liegt zu einem guten Teil an einer unzureichenden Charakterisierung und folglich auch Leistung unter Prozessbedingungen. Zu den Gründen, die einer effektiven und effizienten Anwendung von Enzymen entgegenstehen, gehören unter anderem (I) eine unzureichende Stabilität der Biokatalysatoren unter Prozessbedingungen, oftmals bedingt durch die Nutzung organischer Lösungsmittel, (II) eine geringe Bandbreite an Einsatzmöglichkeiten für ein spezifisches Enzym, aufgrund dessen hoher Substratspezifität und (III) eine geringe Aktivität des Enzyms mit synthetischen, polymeren Substraten. Um diese Herausforderungen zu bewältigen ist es nicht ausreichend, neue Enzymkandidaten zu identifizieren, sondern vielmehr nötig eine detaillierte molekulare Charakterisierung hinsichtlich der relevanten Eigenschaften vorzunehmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 25 (CE02 bis CE26) zuvor teils unbekannte Carboxylester-Hydrolasen aus zwei marinen hydrocarbonoklastischen Bakterien, Alcanivorax borkumensis SK2 und Pseudomonas aestusnigri VGXO14, identifiziert. Darüber hinaus wurden die Enzyme hinsichtlich ihrer Substratpromiskuität, Toleranz für organische Lösungsmittel und Fähigkeit zur Polyesterhydrolyse systematisch untersucht. Für jede dieser Charakteristika wurde ein herausragendes Beispiel gefunden und die zugrundeliegenden molekularen Eigenschaften näher untersucht. Die höchste Substratpromiskuität zeigte das Enzym CE07 aus A. borkumensis. In einer vergleichenden Studie mit mehr als 100 verschiedenen Ester Hydrolasen konnte CE07 unter den 10 Enzymen mit der größten Substratpromiskuität eingeordnet werden. Darüber hinaus ist das Enzym in der Lage besonders komplexe, nicht wasserlösliche Ester, wie sie in der pharmazeutischen Biokatalyse häufig vorkommen, als Substrate anzunehmen. Interessanterweise zeigte CE07 dabei nicht die für hoch promiske Carboxylester-Hydrolasen typische Abwesenheit von Enantioselektivität, sondern eine deutliche Selektivität für zwei von zehn getesteten chiralen Substraten. Mittels molecular-docking Berechnungen für ein Homologiemodell von CE07 mit (R/S)-Menthylacetat als Ligand konnte die Vermutung unterstützt werden, dass die beobachtete Selektivität durch unterschiedliche Reaktionsraten und nicht durch bevorzugte Bindung eines Enantiomers bedingt ist. Zur Bestimmung der Lösungsmitteltoleranz wurde ein neues hochdurchsatzfähiges Verfahren entwickelt und angewandt, welches direkte Messungen mit Zelllysat ermöglichte. So wurde das neue Enzym CE13 aus P. aestusnigri als hochgradig tolerant gegenüber verschiedenen Lösungsmitteln identifiziert; es zeigte selbst nach mehrstündiger Inkubation in 80 % Acetonitril deutliche Restaktivität. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus der Lösungsmittelstabilität von CE13 konnte auf eine hohe Anzahl geladener Aminosäurereste, sowie mehrere Disulfidbrücken zurückgeführt werden, war jedoch nicht mit einer hohen Temperaturstabilität des Enzyms assoziiert. Des Weiteren wurde eine Strategie zum Screening polyesterhydrolytischer Enzyme etabliert, die auf der Verwendung des anionischen aliphatischen Polyester-Polyurethan Impranil DLN als Substrat beruht. Unter allen getesteten Enzymen konnte eines gefunden werden, das deutliche Aktivität mit diesem Substrat zeigte, die Polyesterhydrolase CE16 (ebenfalls PE-H genannt) aus P. aestusnigri. Durch eine nähere biochemische Charakterisierung konnte die Hydrolyse von amorpher PET Folie bei 30 °C nachgewiesen werden. Im Weiteren konnte die Aktivität des Enzyms, mittels einer gezielten Mutagenese, auf PET Folie einer Einwegflasche als Substrat erweitert werden. Die Kristallstruktur des Enzyms und der verbesserten Variante konnte in hoher Auflösung aufgeklärt werden (1.09 Å und 1.35 Å) und wurde als die erste Struktur eines PET hydrolysierenden Enzyms des Typs IIa identifiziert. Basierend auf diesen Enzymstrukturen konnte sowohl die Verbesserung der Aktivität durch einen deutlich besseren Zugang zum aktiven Zentrum des Enzyms begründet, als auch der Bindemechanismus des Polymers nachvollzogen werden. Durch die neugewonnenen Erkenntnisse zur Substratpromiskuität, Lösungsmitteltoleranz und Aktivität gegenüber Polyestern konnte die Möglichkeit evaluiert werden, mehrere dieser Eigenschaften in einem Biokatalysator zu vereinen. Hierbei zeigte sich, dass sich die Eigenschaften Substratpromiskuität und Lösungsmitteltoleranz wahrscheinlich gut vereinen lassen, jedoch molekulare Grundlagen der Polyesterhydrolyse, wie die Positionierung und die Flexibilität des aktiven Zentrums, nicht mit den anderen Charakteristika vereinbar sind. Folglich ist der Versuch, alle Eigenschaften in einem Biokatalysator zu vereinen, utopisch, jedoch ist eine Annäherung an solch einen Biokatalysator in der Zukunft denkbar. Die vorliegende Arbeit trägt somit zu einem tieferen Verständnis von für die industrielle Anwendung relevanten molekularen Eigenschaften von Enzymen aus der Klasse der Carboxylester-Hydrolasen bei, vergrößert die Anzahl der bekannten und charakterisierten Enzyme dieser Klasse und liefert Hinweise für die Entwicklung zukünftiger Biokatalysatoren, die möglichst viele der relevanten Eigenschaften auf sich vereinigen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	07.09.2020
Dateien geändert am:	07.09.2020
Promotionsantrag am:	17.03.2020
Datum der Promotion:	10.08.2020