Dokument: Einfluss des NF-kB-Signalwegs auf die Wirkung von HDAC-Inhibitoren in Urothelkarzinomzellen

Titel:	Einfluss des NF-kB-Signalwegs auf die Wirkung von HDAC-Inhibitoren in Urothelkarzinomzellen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54103
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200907-095057-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Müller, Inka [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,42 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.09.2020 / geändert 02.09.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Schulz, Wolfgang A. [Gutachter] Prof. Dr. Wesselborg, Sebastian [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Inhibitoren von Histondeacetylasen (HDAC-Inhibitoren, HDACi) stellen eine neuartige Therapieoption beim Urothelkarzinom (UC) dar. Während sie sich bei anderen Tumorentitäten bereits in der klinischen Studienphase befinden oder schon zur Therapie zugelassen wurden, blieb ihre Wirkung im invasiven Urothelkarzinom bisher hinter den Erwartungen zurück. Vorarbeiten des Urologischen Forschungslabors der HHU zeigten, dass UC-Zelllinien (UCC) unter der Behandlung mit dem Pan-HDACi SAHA (Vorinostat, Zolinzaͭͫ) die Apoptose umgingen. Eine mögliche Erklärung dafür könnte in der unter SAHA detektierten Induktion von Zellzyklusregulatoren, wie p21CIP1 und Cyclin D1, und des Inhibitors der intrinsischen Apoptose BCL-XL liegen. Da diese Faktoren von Zielgenen des klassischen NF-κB-Signalwegs kodiert werden, wurde in dieser Dissertation untersucht, ob SAHA tatsächlich den klassischen NF-κB-Signalweg aktiviert und eruiert, ob die Kombination von HDACi mit NF-κB-Signalweg-Inhibitoren eine Therapieoption für das UC bietet. Hierfür wurde die Aktivität des klassischen NF-κB-Signalwegs in mehreren UCC unter basalen Bedingungen, nach Aktivierung mit dem bekannten Induktor TNFα, nach Inhibition des Signalwegs auf der Stufe der IκBα-Phosphorylierung durch Bay11-7082 oder Bay11-7085 und nach Behandlung mit SAHA bestimmt. Dazu wurde die Translokation der beiden wichtigsten Transkriptionsfaktoren des klassischen NF-κB-Signalwegs, RelA (p65) und NFκB1 (p50), in den Nukleus immunzytochemisch verfolgt, die Gesamtexpression von RelA (p65) und seines Inhibitors IκBα auf Proteinebene mittels Western Blot-Analyse gemessen und das mRNA-Expressionsniveau der NF-κB-Zielgene CDKN1A (p21CIP1), CCND1 (Cyclin D1), BCL2L1 (BCL-XL), CXCL8 (IL8), XIAP (XIAP) und BIRC5 (Survivin) mittels quantitativer RT-PCR analysiert. Zu Beginn dieser Arbeit konnten die vorbeschriebenen Effekte der SAHA-Behandlung auf benigne Urothelzellen und UCC reproduziert werden. Demnach wirkte SAHA erst in hohen Konzentrationen (≥ 5 µM) deutlich zytotoxisch und Apoptosezeichen waren selten. Die Behandlung der UCC mit TNFα hatte fast ausnahmslos die erwarteten Wirkungen, wie Translokation von RelA in den Nukleus, Induktion der IκBα-Degradation und erhöhte Expression der Zielgene, mit Ausnahme von BIRC5. Basal war RelA im Nukleus nicht nachzuweisen. SAHA führte ebenfalls zu Translokationen von RelA und p50 in den Zellkern, jedoch generell schwächer und zelllinienabhängig. SAHA verminderte in allen drei UCC die Menge von IκBα. Auf mRNA-Ebene induzierte SAHA zelllinienübergreifend die Genexpression von CDKN1A und CXCL8 signifikant, reprimierte jedoch XIAP und BIRC5. Die Wirkung von SAHA auf CCND1 und BCL2L1 hing von der Zelllinie ab. Bay11-7082 hemmte erwartungsgemäß die Wirkungen von TNFα, nahm jedoch keinen Einfluss auf die von SAHA induzierten Effekte. Schließlich wurde die Wirkung von NF-κB-Inhibitoren allein und in Kombination mit SAHA auf die UCC untersucht. Die Blockierung des Signalwegs durch Bay11-7082, Bay11-7085 oder Bortezomib verminderte die Zahl vitaler Zellen in allen UCC. Apoptosezeichen waren unter Bay11-7082 sehr selten, lediglich eine UCC wies morphologische Zeichen der Apoptoseinduktion auf. Auf mRNA-Ebene reprimierte Bay11-7082 zelllinienunabhängig die Expression von XIAP und BIRC5, induzierte CDKN1A und CXCL8 und nahm keinen Einfluss auf die Expression von BCL2L1. Allein die Wirkung auf CCND1 hing von der Zelllinie ab. Die Kombination von SAHA mit Bay11-7082 ergab weder in den Zellvitalitätsassays noch in der quantitativen RT-PCR einen mehr als additiven Effekt, ebenso wenig wie in der Kombination mit dem 26S-Proteasominhibitor Bortezomib. Zusammenfassend lässt sich die Frage nach einer wesentlichen Aktivierung des kanonischen NF-κB-Signalwegs durch SAHA verneinen, auch wenn der HDACi zum Teil auf die gleichen Zielgene wie TNFα wirkt. Die unzureichende Wirkung von SAHA auf die UCC beruht demnach nicht auf einer Aktivierung des klassischen NF-κB-Signalwegs. Inhibitoren des NF-κB-Signalwegs wirken zytotoxisch, jedoch nicht synergistisch mit SAHA. Inhibitors of histone deacetylases (HDAC inhibitors, HDACi) are being investigated as a novel therapeutic option in urothelial carcinoma (UC). However, whereas some HDACi have entered clinical studies or even clinical practice for other tumor entities, their efficacy in UC has been unsatisfactory so far. Previous work in the HHU urological research lab has suggested that UC cell lines (UCC) escape apoptosis activation by the pan-HDACi SAHA (Vorinostat, Zolinza), possibly as a consequence of induction of the cell cycle regulators p21CIP1 and Cyclin D1 as well as the apoptosis inhibitor BCL-XL by SAHA. These three factors are encoded by target genes of the canonical NF-κB pathway. Therefore, the present thesis addressed the idea that SAHA may activate this pathway and that the combination of HDACi with NF-κB pathway inhibitors might thus enhance their efficacy for UC therapy. To address these questions, the activity of the canonical NF-κB pathway was investigated under standard culture conditions, following its activation with its established activator TNFα, its inhibition at the step of IκBα phosphorylation by Bay11-7082 or Bay11-7085, and following treatment with SAHA. For that purpose, the nuclear translocation of the two most important transcription factors of the canonical NF-κB pathway, RelA (p65) and NFκB1 (p50), was followed by immunocytochemistry, protein expression of RelA (p65) and its inhibitor IκBα was determined by western blot analysis and mRNA expression of the NF-κB target genes CDKN1A (p21CIP1), CCND1 (Cyclin D1), BCL2L1 (BCL-XL), CXCL8 (IL8), XIAP (XIAP) and BIRC5 (Survivin) was measured by qRT-PCR. Initially, previously described effects of SAHA on benign urothelial cells and UCC were replicated. As expected, only high SAHA concentrations (≥ 5 µM) were cytotoxic and little apoptosis was apparent. Treatment of UCC with TNFα almost throughout exerted the expected effects, including translocation of RelA into the nucleus, degradation of IκBα and increased expression of target genes, with the exception of BIRC5. Notably, RelA was not detectable in the nuclei under basal growth conditions. SAHA likewise induced RelA nuclear translocation, but much more weakly than TNFα, and in a cell line-dependent manner. Across all cell lines, SAHA induced expression of CDKN1A and CXCL8, but repressed XIAP and BIRC5. Effects on CCND1 and BCL2L1 were cell line-dependent. Bay11-7082 blocked TNFα effects, as expected, but did not influence those of SAHA. Blocking NF-κB signaling by Bay11-7082, Bay11-7085 or bortezomib decreased cell viability in all UCC. Except for one UCC, signs of apoptosis were not evident. Bay11-7082 repressed XIAP and BIRC5 expression across all cell lines, induced CDKN1A and CXCL8, but did not influence BCL2L1 expression. Effects on CCND1 differed among the cell lines. Combining SAHA with Bay11-7082 did not yield more than additive effects on cell viability or gene expression, likewise the combination of SAHA with the proteasome inhibitor bortezomib. In conclusion, SAHA does not appear to significantly activate NF-κB signaling, even though target genes overlap. The limited efficacy of SAHA in UCC is thus not due to activation of the canonical NF-κB pathway. Inhibitors of the pathway are cytotoxic in UCC, but do not act in a synergistic fashion with SAHA.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	07.09.2020
Dateien geändert am:	07.09.2020
Promotionsantrag am:	10.12.2019
Datum der Promotion:	12.08.2020