Dokument: Towards visualizing translation by single-molecule imaging of nascent peptides within hyphae of Ustilago maydis

Titel:	Towards visualizing translation by single-molecule imaging of nascent peptides within hyphae of Ustilago maydis
Weiterer Titel:	Auf dem Weg zur Visualisierung der Translation durch Einzelmolekül-Bildgebung von naszierenden Peptiden in Hyphen von Ustilago maydis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=54062
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200907-124811-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Müntjes, Kira [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 23,35 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.08.2020 / geändert 28.08.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	Ustilago maydis, RNA-transport, Visualizing translation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das polare Wachstum von Zellen hängt von der räumlichen und zeitlichen Regulation der Expression ab. Der aktive Transport von mRNAs entlang des Zytoskeletts, gewährleistet eine definierte Lokalisierung kodierter Proteine. Das polare Wachstum des phytopathogenen Basidomyceten Ustilago maydis basiert auf dem Mikrotubuli-abhängigen Langstreckentransport von mRNAs. Für dieses ist das Schlüssel-RNA-bindende Protein Rrm4 entscheidend, welches Teil von messenger Ribonukleoproteinkomplexen ist. Hier werden verschiedene mRNAs mit Rab5a-positiven Endosomen und molekularen Motorproteinen transportiert. Aufgrund einer Lokalisation von Translationsprodukten der transportierten mRNAs auf Endosomen und der mRNA-Bindung von Rrm4, welche nicht nur in der 3'UTR, sondern auch an Start- und Stopp-Codons der Transkripte erfolgt, wird vermutet, dass translational aktive Einheiten transportiert werden. Dieses Projekt konzentrierte sich auf die Etablierung einer Methode zur Visualisierung der Translation, um translationale Prozesse auf Endosomen sowie die Rolle von Rrm4 bei der Translation zu analysieren. Die Expression eines Peptid-Epitops innerhalb einer Reporter-mRNA ermöglicht die Visualisierung der naszierenden Peptidkette durch die Bindung eines Fluoreszenz-markierten Antikörpers an dieses Peptid-Epitop. Ein weiterer Reporter innerhalb der 3´UTR der Reporter-mRNA ermöglicht eine simultane mRNA-Detektion. Für die Visualisierung der lokalen Translation in Hyphen von U. maydis sollten ein rotes Fluoreszenzprotein zur Markierung der mRNAs, ein Antikörper, eine Degron-Sequenz und ein sogenanntes 2A-Peptid etabliert werden. Für die Markierung der mRNAs innerhalb ihrer 3'UTR wurde das rot fluoreszierende Protein mKate2 etabliert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass sich die analysierten Antikörper GCN4-scFv, BC2-Nb und Moontag-Nb bidirektional in Abhängigkeit von Rab5a-positiven Endosomen und des Mikrotubuli-Zytoskeletts durch Hyphen bewegen. Die Deletion des potentiell interagierenden Proteins UMAG_00933, welches durch eine LC-MS/MS-Analyse gefunden wurde, hob diese Lokalisation auf. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass GCN4-scFv in vivo mit dem zugehörigen Peptid-Epitop interagierte. Daher kann dieser Antikörper potenziell zur Markierung einer naszierenden Peptidkette verwendet werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Degron-Sequenz der Ornithindecarboxylase aus der Maus für die volle Funktionalität am C-Terminus eines Proteins lokalisiert sein muss. P2A wurde mit einer Separationseffizienz von nahezu 100 % etabliert, um eine Degradation des translatierten Peptid-Epitops ohne den vollständigen Abbau der Reporter-mRNA zu ermöglichen. Polar growth of cells depends on the spatiotemporal regulation of expression. Active transport of mRNAs along the cytoskeleton ensures a defined localization of encoded proteins and is an important regulatory mechanism for asymmetric cell division and cell migration. The polar growth of the phytopathogenic basidiomycete Ustilago maydis is based on the long-distance transport of mRNAs along the microtubule cytoskeleton. For transport, the key RNA-binding protein Rrm4 is crucial which is part of messenger ribonucleic particle complexes. Here, different mRNAs, for example septin mRNAs, are hitchhiking on endosomes and transported by molecular motors. Because of an accumulation of translational products of transported mRNAs on endosomes and the mRNA binding of Rrm4 not only in the 3´UTR but also at landmark sites of translation, the hypothesis of translationally active transport units was postulated. To verify this hypothesis, this project was focused on the establishment of an antibody-based method to visualize nascent peptides for the analyzation of translational processes on endosomes as well as the role of Rrm4 in translation. The method can sense translation by encoding a tag sequence within a reporter mRNA that, once translation started, is recognized by an antibody fused to superfolder Gfp. Another RNA-tag within the reporter allows simultaneous mRNA detection. For the visualization of local translation in hyphae of U. maydis, a red fluorescence protein for labeling of mRNAs, an antibody, a degron sequence and a so-called 2A peptide should be established. For the labeling of mRNAs within their 3´UTR, the red fluorescence protein mKate2 was successfully investigated. In addition, it was discovered that the analyzed antibodies GCN4-scFv, BC2-Nb and Moontag-Nb shuttled bidirectionally with Rab5a-positive endosomes in a microtubule-dependent manner through hyphae. Deletion of the potential interacting protein UMAG_00933, which was detected by LC-MS/MS analysis, abolished unspecific shuttling of GCN4-scFv and BC2-Nb. Furthermore, GCN4-scFv interacted with its cognate peptide epitope in vivo. Therefore, this antibody can potentially be used to label a nascent peptide chain. It has been confirmed that for full functionality, a degron sequence from mouse ornithine-decarboxylase has to be located at the C-terminus of a protein. To maintain the equilibrium of proteins encoded by analyzed mRNAs, the 2A peptide P2A was successfully established to separate two open reading frames with separation efficiencies of nearly 100%. This enables a degradation of the expressed peptide epitope to which GCN4-scFv binds to without degrading synthesized proteins encoded by analyzed mRNAs.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	07.09.2020
Dateien geändert am:	07.09.2020
Promotionsantrag am:	30.06.2020
Datum der Promotion:	07.08.2020