Dokument: Untersuchungen zur ATP-vermittelten Sensitivierung der Ovarialkarzinom-Zelllinien HEY und OVCAR-3 gegenüber Cisplatin

Titel:	Untersuchungen zur ATP-vermittelten Sensitivierung der Ovarialkarzinom-Zelllinien HEY und OVCAR-3 gegenüber Cisplatin
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53806
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200730-112639-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Brockmann, Nicole [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,54 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.07.2020 / geändert 21.07.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter] Prof. Dr. Fritz, Gerhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Extrazelluläre Nukleotide, vorwiegend ATP, wirken als Transmitter im purinergen Signaltrans-duktionssystem, einem ubiquitär vorkommenden Kommunikationssystem von Zellen. Dabei interagieren die Nukleotide mit purinergen P1- oder P2-Rezeptoren. Fundamentale physiologische und auch pathophysiologische Prozesse wie die Zell-Homöostase (Proliferation/Apop-tose), glattmuskuläre Kontraktilität, Thrombozytenaggregation, Wundheilung, Neurodegeneration, Immunaktivität oder Entzündungen werden durch die purinerge Zellkommunikation gesteuert. Aktuell rückt die Rolle von ATP und der dazugehörigen P2-Rezeptoren bei Krebserkrankungen in den Fokus der Forschung. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Fragestellung, ob die Chemosensitivität von Ovarialkarzinom-Zelllinien gegenüber Zytostatika wie Cisplatin durch ATP via P2Y2-Rezeptoren moduliert werden kann. Der P2Y2-Rezeptor ist ein ubiquitär im menschlichen Körper vorkommender purinergen Rezeptor. Seine genauen (patho-) physiologischen Funktionen konnten lange Zeit aufgrund fehlender selektiver und potenter Liganden nicht eindeutig bestimmt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zunächst acht verschiedene P2Y-Rezeptor-exprimierende Zelllinien (P2Y1 – P2Y14) etabliert und charakterisiert, um im zweiten Teil eine Arbeitskreis-eigene vom Suramin-abgeleitete chemische Substanz-Bibliothek auf mögliche P2Y2-Rezeptor-selektive Liganden zu screenen. Dies führte zur Entdeckung und Charakterisierung des kompetitiven und nicht-zytotoxischen P2Y2-Antagonisten NF272 mit einem Ki-Wert von 19 µM. Damit ist NF272 14-fach potenter im Vergleich zum unselektiven P2-Antagonisten Suramin (Ki = 265 µM). Ferner zeigte NF272 eine moderate Präferenz gegenüber dem P2Y2-Rezeptor innerhalb der Uracilnukleotid-selektiven Rezeptorsubtypen (P2Y2, P2Y4, P2Y6). Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt von ATP auf die Cisplatin-induzierte Zytotoxizität an den Ovarialkarzinom-Zelllinien HEY und OVCAR-3 untersucht. Die Expression des P2Y2-Rezeptors wurde in beiden Zelllinien mittels PCR und Western Blot nachgewiesen. Ferner wurde seine funktionelle Aktivität mittels Calcium-Studien bestätigt. ATP selbst zeigte nach 72-stündiger Behandlung eine moderate Toxizität mit einer IC50 von 145 µM (HEY) bzw. 240 µM (OVCAR-3). Eine Präinkubation der Zellen mit 100 µM oder 200 µM ATP für 48 Stunden vor der 72-stündigen Coinkubation mit Cisplatin führte zu einer signifikanten Abnahme der IC50 von Cisplatin im Vergleich zu den alleine mit Cisplatin behandelten Kontrollzellen. Dabei wurden je nach Zelllinie und Bedingung Shift-Faktoren zwischen 1,5 und 4,5 beobachtet. Der Einsatz von NF272 oder des literaturbekannten P2Y2-Antagonisten AR-C118925 revertierte die durch ATP verstärkte Zytotoxizität von Cisplatin an beiden Zelllinien vollständig. Die Modulation der Cis-platinchemosensitivität durch ATP wurde somit nachweislich über den P2Y2-Rezeptor vermit-telt. Die Berechnung der Kombinations-Indizes (CI-Werte) nach Chou-Talalay, welche < 0,9 waren, bestätigte einen synergistischen Effekt für die Kombination von ATP und Cisplatin. Zellzyklusanalysen deuteten auf einen ATP-induzierten Zellzyklusarrest in der S-Phase hin. Die gleichzeitige Gabe von ATP und Cisplatin verstärkte synergistisch die Apoptose-Induktion durch Aktivierung der Caspasen 3/7. Es gibt Hinweise auf eine mögliche Beteiligung des EGF-Rezeptors und von mTOR an den ATP-Effekten auf die Ovarialkarzinom-Zelllinien. Unter ATP-Behandlung kam es in HEY-Zellen zur Transaktivierung des EGF-Rezeptors und durch die kombinierte Gabe von ATP und Cisplatin wurde die Expression von mTOR stärker reduziert als durch Cisplatin alleine. Zusammengefasst hat diese Arbeit den kompetitiven P2Y2-Rezeptor-Antagonisten NF272 hervorgebracht. Trotz der nur moderaten Selektivität für den P2Y2-Rezeptor kann NF272 aufgrund seiner geringen Zytotoxizität als Leitstruktur für die Entwicklung Suramin-basierter P2Y2-Rezeptor-Antagonisten dienen. Ferner zeigt diese Arbeit, dass ATP P2Y2-Rezeptor-vermittelt die Cisplatin-Wirksamkeit in synergistischer Weise in den Ovarialkarzinom-Zelllinien HEY und OVCAR-3 erhöht. Dies geht mit einer verstärkten Aktivierung der Caspasen 3/7 und Induktion der Apoptose einher, möglicherweise durch verringerte Expression des proliferationsfördernden mTOR. Stimulation des P2Y2-Rezeptors könnte somit eine neue therapeutische Option für die Behandlung des Ovarialkarzinoms darstellen, um die Sensitivität gegenüber Platin-haltigen Zytostatika zu erhöhen. Extracellular nucleotides, mainly ATP, act as transmitters in the purinergic signalling system, an ubiquitous occurring system of cell communication. Nucleotides interact with purinergic P1- or P2-receptors. Fundamental physiological and pathophysiological processes such as cell homeostasis (proliferation/apoptosis), smooth muscles contractility, platelet aggregation, wound healing, neurodegenerative disorders, immune activity or inflammation are modulated by purinergic signalling. Currently, the role of ATP and its plasma membrane P2-receptors in cancer proliferation enter the focus of P2-receptor research. Starting point of this work was to clarify the question, if chemosensitivity of cytostatic agents like cisplatin could be modulated through ATP via P2Y2 receptors in ovarian cancer cells. The P2Y2 receptor is an ubiquitous occurring purinergic receptor in humans. Evaluation of its complete (patho-) physiological role has long been hampered due to the lack of selective and potent ligands. In the first part of this work, eight different P2Y-receptor-expressing cell lines (P2Y1 – P2Y14) were established and characterized, in order to screen an in-house synthesized suramin-derived compound library for possible P2Y2-receptor selective ligands in the second part. This resulted in the discovery and characterization of NF272, a competitive and non-cytotoxic P2Y2-receptor antagonist with a Ki-value of 19 µM. NF272 is 14-fold more potent than the unselective P2-receptor antagonist suramin (Ki = 265 µM). Further, NF272 showed a moderate selectivity for P2Y2 among uracilnucleotide-selective P2-receptor subtypes (P2Y2, P2Y4, P2Y6). The third part of this work aimed to investigate the effect of ATP upon cisplatin-induced cytotoxicity in ovarian cancer cell lines HEY and OVCAR-3. P2Y2-receptor expression in both cell lines was verified by PCR and western blot analysis. Furthermore, its functional activity was confirmed by calcium studies. ATP itself displayed moderate cytotoxicity with IC50-values of 145 µM (HEY) and 240 µM (OVCAR-3) in cell viability assays after 72 h of treatment. However, pre-incubation with 100 µM or 200 µM ATP for 48 h prior to 72 h incubation with cisplatin resulted in a significant decrease of cisplatin IC50-values compared to cisplatin treatment alone. Depending on conditions and cell line, shift factors between 1.5 and 4.5 were observed. Presence of NF272 or the known P2Y2 receptor antagonist AR-C118925 completely abrogated the ATP-enhanced cisplatin cytotoxicity in both cell lines. Therefore in ovarian cancer cells, the modulation of cisplatin chemosensitivity by ATP was demonstrably mediated by P2Y2 receptors. By determining combination index values (CI-values) according to Chou-Talalay of less than 0.9, the combination of cisplatin and ATP was found to be synergistic. Cell cycle analysis showed cell cycle arrest in S-phase induced by ATP. Combined treatment of ATP and cisplatin significantly enhanced the induction of apoptosis by activation of caspases 3/7 in a synergistic manner. Likewise, there is first evidence of possible involvement of EGF receptors and mTOR upon ATP treatment in ovarian cancer cells. After treatment of HEY cells with ATP, transactivation of EGF receptors was observed and moreover, expression of mTOR was more reduced after treatment with ATP plus cisplatin as compared to cisplatin treatment alone. In conclusion, this work identifies the competitive P2Y2 receptor antagonist NF272. Despite an only moderate selectivity for P2Y2 receptors NF272 may serve as a lead structure for the development of suramin-derived P2Y2 receptor antagonists due to its low cytotoxicity. In addition this work demonstrates that in the ovarian cancer cell lines HEY and OVCAR-3, ATP enhances cisplatin potency via P2Y2 receptors in a synergistic manner. This goes along with an increased activation of caspases 3/7 and induction of apoptosis, possibly through a decreased expression of mTOR. Therefore, stimulation of P2Y2 receptors may be a new therapeutic option for treatment of ovarian cancer to increase the sensitivity towards platinum-based cytostatic agents.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	30.07.2020
Dateien geändert am:	30.07.2020
Promotionsantrag am:	19.12.2019
Datum der Promotion:	24.06.2020