Dokument: Evaluation des senolytischen Potentials einer marinen Naturstoffbibliothek
| Titel: | Evaluation des senolytischen Potentials einer marinen Naturstoffbibliothek | |||||||
| Weiterer Titel: | Evaluation of the senolytic potential of a marine natural compound library | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53735 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20200716-105752-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Neuwahl, Judith [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jänicke, Reiner [Gutachter] PD Dr. rer. nat. Stork, Björn [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Senolytika, PX-866, Seneszenz, HCT116, MCF-7, PI3K | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die zelluläre Seneszenz ist ein irreversibler, permanenter Zellzyklusarrest und stellt neben der Apoptose (programmierter Zelltod) eine Möglichkeit für Zellen dar, auf eine irreparable Schädigung ihrer DNA zu reagieren. Beide Mechanismen können in Tumorzellen durch eine Chemo- oder Radiotherapie induziert werden, dennoch handelt es sich nicht um gleichwertige Therapieziele. Seneszente Zellen sind zwar teilungsunfähig, aber sie bleiben metabolisch aktiv und bilden einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) aus, durch den sie über Sekretion verschiedener Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren ein inflammatorisches Mikromilieu generieren und die Proliferation benachbarter Tumorzellen fördern können. Langfristig können seneszente Zellen so Therapienebenwirkungen nach einer Radio- oder Chemotherapie bedingen und sogar die Bildung von Tumorrezidiven und Metastasen fördern. Aus diesem Grund entwickelte sich ein neuer Therapieansatz mit dem Ziel, selektiv seneszente Zellen durch niedermolekulare Substanzen (sogenannte Senolytika) zu eliminieren. Die Mehrzahl aller bisher beschriebenen Senolytika sind ausschließlich in nicht-malignen Zellen in Bezug auf altersassoziierte Erkrankungen getestet worden, da auch hier seneszenten Zellen eine zentrale Rolle zugeschrieben wird. Der Fokus der vorliegenden Forschungsarbeit lag hingegen auf der gezielten Eliminierung seneszenter Tumorzellen im Rahmen von onkologischen Erkrankungen. Insbesondere die Depletion sogenannter Therapie-
induzierter seneszenter Zellen birgt das Potential, den gesamten Krankheitsverlauf positiv zu beeinflussen. Das Ziel der vorliegenden Forschungsarbeit bestand darin, eine marine Naturstoffbibliothek (Prof. P. Proksch, HHU Düsseldorf) auf Substanzen zu untersuchen, die in den Kolon- und Mammakarzinomzelllinien HCT116 bzw. MCF-7 eine senolytische Wirkung zeigen. Die DNA-Schädigungs-induzierte Seneszenz wurde durch Behandlung der Zellen mit 10 Gy einer ionisierenden Röntgenstrahlung erreicht. Eine Substanz wurde dann als senolytisch klassifiziert, wenn sie seneszente Zellen gezielt abtötete, ohne dass gleichzeitig behandelte, proliferierende Kontrollzellen angegriffen wurden. Mittels des Kristallviolett- Zytotoxizitätstests wurde eine Substanz identifiziert, die in beiden Tumorzelllinien senolytisch wirkte: der Phosphoinositid-3-Kinase- (PI3K-) Inhibitor Wortmannin. Mit mehreren Methoden zur Zelltodquantifizierung, wie die durchflusszytometrische Messung der Propidiumiodid-Aufnahme und die Messung der freigesetzten LDH-Aktivität, konnte die senolytische Wirkung von Wortmannin verifiziert werden. Darüber hinaus zeigte auch das deutlich stabilere und bereits in klinischen Studien eingesetzte Wortmannin-Derivat PX-866 selbst in geringeren Konzentrationen als Wortmannin einen senolytischen Effekt in beiden Tumorzelllinien. Auf molekularer Ebene konnte gezeigt werden, dass Wortmannin und PX-866 in HCT116 und MCF-7-Zellen die Expression des für das Seneszenzprogramm essentiellen CDK-Inhibitors p21 WAF1/Cip1 inhibieren. Zur weiteren Charakterisierung des senolytischen Wirkmechanismus wurden andere, Isoform-spezifische PI3K-Inhibitoren auf ihren zytotoxischen Effekt in proliferierenden und seneszenten Zellen hin untersucht. Da PI3K Teil einer proliferations- und überlebensfördernden Signalkaskade ist, in der auch die nachgeschalteten Proteine AKT und mTOR eine zentrale Rolle übernehmen, wurde ebenfalls evaluiert, inwiefern deren spezifische Inhibition senolytisch wirkt. Keiner der getesteten Inhibitoren konnte jedoch den senolytischen Effekt von PX-866 vollständig reproduzieren. Lediglich der α-Isoform-spezifische PI3K-Inhibitor BYL719 zeigte zumindest verzögert einen annähernd ähnlichen senolytischen Effekt. Obwohl der senolytische Wirkmechanismus von Wortmannin und PX-866 noch nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, lässt sich zusammenfassend sagen, dass das klinisch einsetzbare Wortmannin-Derivat PX-866 einen vielversprechenden Kandidaten darstellt, der zukünftig als therapeutisch verwendbares Senolytikum einen neuen Weg in der Behandlung onkologischer Erkrankungen ermöglichen könnte.Cellular senescence is an irreversible and permanent cell cycle arrest that together with the process of apoptosis (programmed cell death) determines cellular fate in response to an irreparable DNA damage. Both mechanisms can be induced in tumour cells by radio- or chemotherapy, yet they do not represent equivalent therapeutic aims. Even though senescent cells cease dividing, they remain metabolically active and secrete cytokines, chemokines and growth factors to generate the so-called senescence-associated secretory phenotype (SASP). Thereby, senescent cells create a proinflammatory microenvironment that is able to promote the proliferation of neighbouring tumour cells. Chronically persisting senescent cells can cause adverse effects during cancer treatment and may even lead to the development of metastases and cancer relapse. The endeavour to selectively kill senescent cells has led to the identification of a novel class of small molecules called senolytics. Almost all senolytics that have been described so far were examined in non-malignant cells and their role in age-associated diseases, since it is well known that senescent cells are often the main cause of age-related disorders. The focus of the present research project, however, has been on eliminating senescent tumour cells in the context of oncological diseases. Especially the selective depletion of therapy-induced senescent cells, could contribute to a substantial improvement in the course of malignant disorders. The aim of this thesis was to screen a marine natural compound library (Prof. P. Proksch, HHU Düsseldorf) for substances showing senolytic activity towards senescent HCT116 (colon carcinoma) and MCF-7 (breast carcinoma) cells. The DNA damage-induced cellular senescence was achieved by using 10 Gy of ionizing X-radiation. A substance was classified as senolytic if it selectively killed senescent cells without harming equally treated proliferating control cells. Employing the crystal violet cytotoxicity assay, the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) inhibitor wortmannin was identified as a potential senolytic killing both senescent tumour cell lines. Several other methods to quantify cell death such as the determination of propidium iodide uptake by flow cytometry or measurement of released LDH-activity, verified the senolytic potential of wortmannin. In addition, the more stable wortmannin-derivative PX-866, which has already been tested in clinical trials, also turned out to exert a similar senolytic activity towards both cell lines. On the molecular level, wortmannin and PX-866 inhibit the expression of p21WAF1/Cip1, a CDK-inhibitor essential for activating and maintaining the senescence program. For further investigations of the molecular mechanism(s) underlying the senolytic effect, other isoform-specific PI3K- inhibitors were tested regarding their cytotoxicity towards senescent and proliferating HCT116 and MCF-7 cells. Since PI3K and its downstream targets AKT and mTOR are part of a pro-survival and proliferation-enhancing signalling cascade, it was evaluated whether the specific inhibition of these downstream targets also leads to selective elimination of senescent cells. However, neither of the inhibitors tested was able to reproduce the senolytic effect of PX-866. Only the α-isoform-specific PI3K inhibitor BYL719 demonstrated a similar but delayed senolytic activity compared to PX-866. Even though the molecular mechanisms underlying the senolytic effect of wortmannin and PX-866 have not yet been completely elucidated, the wortmannin-derivative PX-866 constitutes a promising candidate for future clinical applications in the context of senolytic therapies and could thus enable new ways of treating oncological diseases. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.07.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.07.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 16.04.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 09.07.2020 |
