Dokument: Isolation and cellular characterization of the hemolysin A type 1 secretion system from Escherichia coli

Titel:	Isolation and cellular characterization of the hemolysin A type 1 secretion system from Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53734
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200716-105128-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Beer, Tobias [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 35,39 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.07.2020 / geändert 14.07.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Type one secretion system, T1SS, Escherichia coli, Hemolysin, ABC-Transporter, TolC, HlyA, HlyB, HlyD
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Sekretionssysteme sind essentielle Nanomaschinen in Gram-negativen Bakterien. Sie erlauben die Kommunikation aus der Zelle über den Transport von Proteinen und Signalmolekülen. Das Typ eins Sekretionssystem (T1SS) ist ein Paradebeispiel für Sekretionssysteme in Gram-negativen Bakterien. Das T1SS kann eine Vielfalt an Substraten über beide Membranen, in den extrazellulären Raum, transportieren. Die Substrate können in ihrer Größe von 19 kDa bis 1.5 MDa stark variieren. Dies gilt auch für ihre Funktionen der Substrate: Hämophore, Lipasen, Adhesionsfaktoren, Oberflächenproteine und Toxine. Die Substrate teilen gemeinsame Merkmale. Ein C-terminales Sekretionssignal das nicht während des Transports entfernt wird, während das Substrate in einem ungefalteten Zustand transportiert wird. Ein bekanntes Beispiel für T1SS ist das Hemolysin A (HlyA) T1SS. Es besteht aus dem ABC Transporter Hemolysin B (HlyB), einem Membranfusionsprotein (MFP) Hemolysin D, dem äußeren Membranprotein (OMP) TolC und dem Substrat HlyA, welches zur repeats in toxins (RTX) Familie gehört. In der Anwesenheit von HlyA wird durch den inneren Membrankomplex (IMC), bestehend aus HlyB und HlyD das OMP TolC rekrutiert und ein Translokalisationspfad wird durch beide Membranen gebildet Während der Forschung für diese Doktorarbeit wurde die Sekretionsrate des HlyA T1SS quantifiziert und der Einfluss von Calcium Ionen untersucht. Dazu wurde ein N-terminales Fusionskonstrukt aus HlyA mit einem schnell faltenden GFP verwendet, dass es ermöglicht das HlyA T1SS während der Translokation zu arretieren. Dieser experimentelle Aufbau ermöglicht die Quantifizierung von ca. 5000 aktiven HlyA T1SS während der Überexpression im Laborstamm E. coli BL21(DE3). Die Sekretion von HlyA in Kulturmedium wurde anschließend in Anwesenheit bzw. Abwesenheit verschiedener Calciumionenkonzentrationen beobachtet. Durch die Zahl der aktiven T1SS war es dadurch möglich die Sekretionsrate des HlyA T1SS mit 16 Aminosäuren pro Transporter und Sekunde zu bestimmen. Die Sekretionsrate ist unbeeinflusst vom Verhältnis von Proteinlänge zur Menge der Glycin reichen Wiederholungen und der extrazellulären Calciumionenkonzentration. Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurde die Oberflächenlokalisation der arretierten T1SS charakterisiert. Zur Beurteilung des Oberflächenverteilungsmusters wurde der parentale E. coli Stamm UTI89 verwendet. In UTI89 steht das HlyA T1SS unter endogener Expressionskontrolle und wurde untersucht, während es mit dem GFP fusionierten HlyA arretiert wurde. Unabhängig von der Überexpression in BL21(DE3) oder der endogenen Expression in UTI89 war für das HlyA T1SS keine eindeutige Lokalisation auf der Zelloberfläche zu beobachten. Zusätzlich wurde der arretierte Komplex verwendet, um die Menge an aktivem HlyA T1SS in UTI89 zu bestimmen. Während der endogenen Expression wurden etwa 800 aktive HlyA T1SS quantifiziert, verglichen mit etwa 5000 T1SS, die in BL21(DE3) überexprimiert wurden. Weiterhin wurde der Einfluss der TolC Arretierung durch das HlyA T1SS untersucht. Die Zahl der TolC-Trimere wurde quantifiziert während der Expression des HlyA T1SS auf endogenem, überexprimiertem Niveau und dessen abwesenheit. Die Anzahl an TolC waren mit etwa 5000 Trimeren unabhängig vom Besetzungsanteil nicht signifikant beeinflusst. Zuletzt wurde die mögliche Aufreinigung des arretierte T1SS untersucht. Es wurde gezeigt, dass es möglich ist Membranen mit dem T1SS zu isolieren und solubilisieren allerdings ist die Stabilität des Komplexes während der Reinigung nicht gewährleistet. Einführung von Quervernetzung führte zu einer Vielzahl an Quervernetzungsprodukten, weshalb neue Methoden für die Reinigung vorgeschlagen werden. Secretion system are essential for Gram-negative bacteria as these nanomachineries allow communication with the outside by exporting proteins or signal molecules. The type one secretion system (T1SS) is a prime example for secretion systems in Gram-negative bacteria. It is able to secrete a broad range of substrates across both membranes, into the extracellular space. The substrates can vary drastically in size from 19 kDa up to 1.5 MDa also varying in function like, hemophores, lipases, adhesion factors, surface layer proteins to toxins. All substrates show a common features the C-terminal secretion signal which is not cleaved during the secretion. One well known example for the T1SS is the hemolysin A (HlyA) T1SS, which consists of an ABC transporter hemolysin B (HlyB), a membrane fusion protein (MFP) hemolysin D (HlyD), the outer membrane protein (OMP) TolC and the substrate HlyA, a member of the repeats in toxins (RTX) family. In the presence of the substrate HlyA the inner membrane complex (IMC), consisting of HlyB and HlyD recruits TolC and forms a translocation pathway through the membranes. During this doctoral research, the secretion rate of the HlyA T1SS was quantified and the influence of calcium ions was investigated. This was established by using an N-terminal fusion construct of HlyA with a fast folding GFP allowing to arrest the T1SS during translocation. This experimental procedure allowed to determine approximately 5000 active HlyA T1SS when overexpressed in the laboratory strain E. coli BL21(DE3). The secretion of HlyA in culture medium was subsequently observed in the presence or absence of different calcium ion concentrations. Due to the number of active T1SS it was possible to determine the secretion rate of the HlyA T1SS with 16 amino acids per transporter and second. Revealing that the secretion rate is unaffected by proportion from protein length to amount of glycine rich repeats and the extracellular calcium ion concentration. Via fluorescence microscopy the surface localization of stalled T1SS was characterized. To evaluate the surface distribution pattern the parental E. coli strain UTI89 was utilized. In UTI89 the HlyA T1SS is under endogenous expression control and was investigated while arrested with a GFP-HlyA fusion protein. Regardless of overexpression in BL21(DE3) or endogenous expression in UTI89 no distinct localization on the cell surface was observable for the HlyA T1SS. Additionally, the stalled complex was utilized to determine also the amount of active HlyA T1SS in UTI89. During endogenous expression approximately 800 active HlyA T1SS where quantified compared to approximately 5000 T1SS while overexpressed in BL21(DE3). Further, the influence of TolC arrestment through the HlyA T1SS was investigated. The number of TolC trimer was quantified during expression of the HlyA T1SS at endogenous, overexpressed levels and its absence. TolC levels showed on significant influence with approximately 5000 trimers regardless of portion of occupation. Last, the topic of possible purification of the stalled HlyA T1SS was investigated. Showing that obtaining membranes and solubilizing the stalled complex is possible but during purification, the integrity of the complex was compromised. Introduction of crosslinker resulted in a multitude of crosslink products leading to suggestions for novel approaches to purify the T1SS.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	16.07.2020
Dateien geändert am:	16.07.2020
Promotionsantrag am:	20.04.0020
Datum der Promotion:	16.06.0020