Dokument: Engineering of Corynebacterium glutamicum towards increased malonyl-CoA availability for polyketide synthesis

Titel:	Engineering of Corynebacterium glutamicum towards increased malonyl-CoA availability for polyketide synthesis
Weiterer Titel:	Optimierung von Corynebacterium glutamicum zur erhöhten Malonyl-CoA Verfügbarkeit für die Polyketidsynthese
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53722
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200716-104314-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Milke, Lars [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 74,91 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.07.2020 / geändert 13.07.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Stichwörter:	Corynebacterium glutamicum, Malonyl-CoA, Polyketide, Metabolic engineering, Plant natural products
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Polyketides are a structurally highly diverse group of natural products with interesting healthpromoting effects on humans. Despite all structural differences, polyketides are synthesized from simple CoA-activated carboxylic acid derivatives, such as acetyl-CoA or malonyl-CoA following a mechanism closely related to fatty acid biosynthesis. Unfortunately, polyketides are only synthesized in small quantities by the respective native organism. In contrast, microbial polyketide synthesis using engineered bacteria is a promising approach to get access to the desired products. Against this background, Corynebacterium glutamicum strains for the production of different plant polyketides such as stilbenes and flavonoids have been constructed recently. However, it soon became evident that the intracellular availability of malonyl-CoA is limiting the overall product formation in these strains. Hence, the main goal of this thesis was to optimize the intracellular malonyl-CoA availability in C. glutamicum by metabolic engineering. Additionally, the tailored strains should be used for establishing synthesis of biotechnological interesting polyketides. The following results were obtained: 1) Reduction of the citrate synthase activity to 5.5 % compared to the C. glutamicum wild type by exchanging the promotor of the encoding gltA gene, reduced acetyl-CoA consumption via the tricarboxylic acid cycle, which in turn improved malonyl-CoA availability. Upon transcriptional deregulation of accBC and accD1 encoding the two subunits of acetyl-CoA carboxylase, malonyl-CoA synthesis from acetyl-CoA was drastically improved allowing for the synthesis of 65 mg/L (0.24 mM) naringenin und 450 mg/L (1.97 mM) resveratrol. Furthermore, improving the glucose uptake and elimination of anaplerotic pyruvate carboxylation reaction further contributed to an improved intracellular malonyl-CoA availability in the ultimately constructed strain C. glutamicum M-CoA. 2) Through episomal expression of genes encoding heterologous type III polyketide synthases from various plant species in the constructed strain C. glutamicum M-CoA, microbial synthesis of a pentaketide (noreugenin) but also phenylbutanoids raspberry ketone, zingerone, benzylacetone) with a ldhA-deficient variant could be established. The respective strains allowed for the synthesis of up to 53.3 mg/L (0.28 mM) noreugenin, 100 mg/L (0.61 mM) raspberry ketone, 70 mg/L (0.36 mM) zingerone and 10.5 mg/L (0.07 mM) benzylacetone from simple precursor molecules, respectively. 3) Hitherto, only type III polyketides can be synthesized by engineered C. glutamicum strains. In the context of this study, functional expression of a codon-optimized gene variant encoding the type I polyketide synthase 6-methylsalicylic acid synthase ChlB1 from Streptomyces antibioticus of 1,756 amino acids size was achieved. This allowed for the synthesis of up to 41 mg/L (0.27 mM) 6-methylsalicylic acid. It was found that C. glutamicum has an endogenous phosphopantetheinyltransferase activity, which can post-translationally activate ChlB1. This makes C. glutamicum a promising host for the production of other interesting type I polyketides. Polyketide sind eine Gruppe strukturell vielfältiger Naturprodukte mit interessanten gesundheitsfördernden Eigenschaften für den Menschen. Trotz aller strukturellen Unterschiede werden Polyketide aus einfachen CoA-aktivierten Carbonsäurederivaten wie Acetyl-CoA oder Malonyl-CoA nach einem mit der Fettsäurebiosynthese eng verwandten Mechanismus synthetisiert. Leider werden Polyketide im jeweiligen nativen Organismus nur in geringen Mengen produziert. Im Gegensatz dazu ist die heterologe mikrobielle Synthese mit entwickelten Bakterienstämmen ein vielversprechender Ansatz, um Zugang zu den gewünschten Produkten zu erhalten. In diesem Zusammenhang wurden kürzlich Corynebacterium glutamicum Stämme zur Synthese verschiedener pflanzlicher Polyketide wie Stilbene und Flavonoide konstruiert. Es zeigte sich jedoch bald, dass die intrazelluläre Verfügbarkeit von Malonyl-CoA die gesamte Produktbildung in diesen Stämmen limitiert. Daher war das Hauptziel dieser Arbeit die Optimierung der intrazellulären Malonyl-CoA Verfügbarkeit in C. glutamicum durch metabolic engineering. Darüber hinaus sollten die maßgeschneiderten Stämme für die Etablierung der Synthese biotechnologisch interessanter Polyketide verwendet werden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) Die Verringerung der Citrat-Synthase Aktivität auf 5,5 % im Vergleich zum C. glutamicum Wildtyp durch Promotoraustausch des kodierenden gltA-Gens, reduzierte den Verbrauch von Acetyl-CoA durch den Tricarbonsäurezyklus und verbesserte damit die Malonyl-CoA Verfügbarkeit. Durch die transkriptionelle Deregulierung von accBC und accD1, die für die zwei Untereinheiten der Acetyl-CoA Carboxylase kodieren, wurde die Malonyl-CoA-Synthese ausgehend von Acetyl-CoA drastisch verbessert, sodass letztendlich 65 mg/L (0,24 mM) Naringenin und 450 mg/L (1,97 mM) Resveratrol synthetisiert werden konnten. Darüber hinaus trugen die Verbesserung der Glukoseaufnahme und die Beseitigung der anaplerotischen Pyruvatcarboxylierungsreaktion weiterhin zu einer verbesserten Malonyl-CoA Verfügbarkeit im konstruierten Stamm C. glutamicum M-CoA bei. 2) Durch episomale Expression von Genen, die für heterologe Typ III Polyketid Synthasen aus verschiedenen Pflanzenarten im konstruierten Stamm C. glutamicum M-CoA, konnte die mikrobielle Synthese eines Pentaketids (Noreugenin) aber auch von Phenylbutanoiden (Himbeerketon, Zingeron, Benzylaceton) mit einer ldhA-defizienten Variante nachgewiesen werden. Die jeweiligen Stämme erlaubten die Synthese von bis zu 53,32 mg/L (0,28 mM) Noreugenin, 100 mg/L (0,61 mM) Himbeerketon, 70,03 mg/L (0,36 mM) Zingeron und 10,5 mg/L (0,07 mM) Benzylaceton aus einfachen Vorläufermolekülen. 3) Bisher können nur Typ III Polyketide mit C. glutamicum-Stämmen synthetisiert werden. Im Rahmen dieser Studie wurde die funktionelle Expression einer codon-optimierten Genvariante erreicht, die für die Typ I Polyketid Synthase 6-Methylsalicylsäure Synthase ChlB1 aus Streptomyces antibioticus von 1756 Aminosäuren Größe kodiert. Dies ermöglichte die Synthese von 41 mg/L (0,27 mM) 6-Methylsalicylsäure. Weiterhin wurde festgestellt, dass C. glutamicum eine endogene Phosphopantetheinyltransferase besitzt, die ChlB1 posttranslational aktivieren kann. Dies macht C. glutamicum zu einem vielversprechenden mikrobiellen Wirt für die Synthese weiterer interessanter Typ I Polyketide.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	16.07.2020
Dateien geändert am:	16.07.2020
Promotionsantrag am:	17.12.2019
Datum der Promotion:	18.05.2020