Dokument: Die Funktion des Chlamydia pneumoniae Adhäsins LIPP und seines humanen Interaktionspartners 14-3-3ζ in der Infektion
| Titel: | Die Funktion des Chlamydia pneumoniae Adhäsins LIPP und seines humanen Interaktionspartners 14-3-3ζ in der Infektion | |||||||
| Weiterer Titel: | Function of the Chlamydia pneumoniae adhesin LIPP and its human interaction partner 14-3-3ζ in the infection | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53599 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20200701-112030-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Hanisch, Philipp Timo [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter] Prof. Dr. Lutz Schmitt [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | CPn0473, LIPP, Chlamydia pneumoniae, adhesion, plasma membrane | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das obligat intrazelluläre humanpathogene Bakterium Chlamydia pneumoniae (Cpn) nutzt verschiedene Adhäsine, um an die Wirtszelle zu binden. Neben dem Outer membrane complex B Protein (OmcB), welches Bindung über Heparansulfat-ähnliche Glykosaminoglykane (HS-ähnliche GAGs) vermittelt, und
dem Polymorphen Membranprotein 21 (Pmp21), das mit dem humanen epidermal growth factor receptor (EGFR) interagiert, konnte CPn0473 als weiteres Cpn spezifisches Adhäsin beschrieben werden. Nach Bindung an einen unbekannten, humanen Interaktionspartner interagiert das Adhäsin mit negativ geladenen Phospholipiden und externalisiert selbstständig Phosphatidylserin (PS) von der inneren auf die äußere Lipidschicht der humanen Plasmamembran. Eine Vorinkubation von humanen Zellen mit rekombinantem CPn0473 (rCPn0473) führt zu einem Infektions-erhöhenden Effekt bei einer nachfolgenden Infektion. Über die potenzielle C-terminale Transmembrandomäne (TM) ist das Protein in der Lage Membranen zu penetrieren. Der genaue Mechanismus der PS Bindung und PS Externalisierung sowie der Membranpenetration ist bis jetzt ungeklärt. Aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeiten wurde CPn0473 in Lipid Internalization Promoting Protein, kurz LIPP, umbenannt. In dieser Arbeit sollte ein möglicher humaner Interaktionspartner von LIPP identifiziert und die Interaktion von LIPP mit der Plasmamembran näher charakterisiert werden, um dessen Funktion innerhalb der frühen, chlamydialen Infektion weiter aufzuklären. Bindestudien an GAG-defizienten Zelllinien zeigten, dass LIPP, ähnlich wie OmcB, über HS-ähnliche GAGs an die humane Zelle bindet. Eine Vorinkubation von rLIPP mit Heparin hob die Bindung sowie den Infektions-erhöhenden Effekt auf. Über einen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen konnte das humane, zytosolische Adapterprotein 14-3-3ζ als Interaktionspartner identifiziert werden. In vitro Pulldown-Experimente zeigten, dass rLIPP und r14-3-3ζ biochemisch miteinander interagieren. In Transfektionsexperimenten und Experimenten an Cpn infizierten Humanzellen wurde die in vivo Interaktion gezeigt. Adhäsionsexperimente an humanen Zellen und Versuche mit r14-3-3ζ gefüllten giant unilamellar vesicles (GUVs) demonstrierten, dass rLIPP in der Lage ist 14-3-3ζ selbständig vom Zytosol zur humanen Plasmamembran zu rekrutieren. Eine erhöhte, zytosolische 14-3-3ζ Verfügbarkeit bedingt eine erhöhte Aufnahme der elementary bodies (EBs) während der frühen Cpn Infektion und führt zu einer Vermehrung chlamydialer Einschlüsse 48 h nach der Infektion. Um mit 14-3-3ζ zu interagieren muss LIPP die humane Plasmamembran durchdringen. Mittels bioinformatischer Analyse konnten drei amphipathische Helices (APHs) innerhalb des LIPP N-Terminus identifiziert werden. Bindestudien an GUVs und Humanzellen zeigten, dass die ersten beiden APHs essenziell für die PS Bindung und PS Externalisierung sind, während die dritte APH einen regulativen Effekt vermittelt und die Membranpenetration fördert. Eine Deletion der ersten APH führte zudem zum Verlust des Infektions-erhöhenden Effekts und der 14-3-3ζ-Interaktion, womit sie unerlässlich für die erhöhte Aufnahme der Cpn EBs ist. Dies ist das erste Beispiel eines bakteriellen Adhäsins, welches mittels dreier APHs und einer TM eine Membran penetriert, um PS zu externalisieren und mit einem zytosolischen Adapterprotein zu interagieren.The obligate intracellular human pathogenic bacterium Chlamydia pneumoniae (Cpn) uses various adhesins to bind to the host cell. In addition to the outer membrane complex B protein (OmcB), which mediates binding via heparan sulfate-like glycosaminoglycans (HS-like GAGs) and the polymorphic membrane protein 21 (Pmp21), which interacts with the human epidermal growth factor receptor, CPn0473 has been described as an additional Cpn specific adhesin. After binding to an unknown human interaction partner, the adhesin interacts with negatively charged phospholipids and externalizes phosphatidylserine (PS) from the inner to the outer leaflet of the human plasma membrane. A preincubation of human cells with recombinant CPn0473 (rCPn0473) leads to an infection enhancing effect during a subsequent Cpn infection. Via a predicted C-terminal transmembrane domain (TM), the protein can penetrate membranes. The exact mechanisms of PS binding and PS externalization as well as membrane penetration remains unknown. Due to its unique properties, CPn0473 was renamed Lipid Internalization Promoting Protein (LIPP). The aim of this work was to identify a human interaction partner of LIPP and furthermore characterize the interaction of LIPP with the human plasma membrane to elucidate its function within the early chlamydial infection. Binding studies on GAG-deficient cells showed that LIPP, like OmcB, binds to human cells via HS-like GAGs. Preincubation of rLIPP with heparin inhibited LIPP binding and the infection increasing effect. Using a yeast two-hybrid screen, the cytosolic human adapter protein 14-3-3ζ was identified as an interaction partner. In vitro pull-down experiments showed that rLIPP and 14-3-3ζ interact biochemically. Transfection experiments and experiments with Cpn infected cells demonstrated the in vivo interaction. Adhesion experiments on human cells and experiments on giant unilamellar vesicles (GUVs) with luminal r14-3-3ζ demonstrated that rLIPP on its own recruits 14-3-3ζ to the inner leaflet of the membrane. An enhanced cytosolic 14-3-3ζ availability leads to an increased uptake of elementary bodies (EBs) during early Cpn infection and to more chlamydial inclusions 48 h post infection. To interact with 14-3-3ζ, LIPP must penetrate the human plasma membrane. Using bioinformatic analysis, three amphipathic helices (APHs) were identified within the LIPP N-terminus. Binding studies on GUVs and human cells showed that the first two APHs are essential for PS binding and PS externalization, while the third APH mediates a regulatory effect and increases the LIPP mediated membrane penetration. Deletion of the first APH additionally leads to the loss of the infection enhancing effect and the interaction with14-3- 3ζ, making it essential for the Cpn EB uptake. This is the first example of a bacterial adhesin that uses three APHs and a TM to penetrate a membrane, externalize PS and interact with a cytosolic adapter protein. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Bezug: | 04.01.2016 – 19.12.2019 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen | |||||||
| Dokument erstellt am: | 01.07.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 01.07.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 15.02.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 19.12.2019 |
