Dokument: Methylierungsanalysen der miR200-Familie bei zirkulierenden Tumorzellen
| Titel: | Methylierungsanalysen der miR200-Familie bei zirkulierenden Tumorzellen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53559 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20200709-104212-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Pixberg, Constantin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof.Dr. Stoecklein, Nikolas [Gutachter] PD Dr. med. Schroeder, Thomas [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Zirkulierende Tumorzellen; CTC; CTCs; miR200; EMT; epitheliale-mesenchymale Transition; Einzelzellen; Methylierung; | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die epitheliale-mesenchymale-Transition (EMT), bei der epitheliale Tumorzellen einen mesenchymalen Phänotyp erlangen können, gilt als wichtiger Treiber der Tumorprogression und Metastasierung. Bei der Steuerung von EMT-Prozessen scheint die Regulierung EMT-assoziierter Gene durch DNA-Methylierung entscheidend zu sein. Die Methylierungsanalyse von aus der Blutzirkulation angereicherten und isolierten zirkulierenden Tumorzellen (CTCs), die als potentielle Vorläuferzellen von Metastasen gelten, eröffnet in diesem Sinne neue Möglichkeiten, den Einfluss von DNA-Methylierung auf die EMT nachvollziehen zu können. Tatsächlich können meist nur wenige CTCs pro Patient angereichert und isoliert werden, so dass Analysen mit sehr wenigen Zellen oder gar Einzelzellen als Ausgangsmaterial durchgeführt werden müssen. Während dieser Arbeit wurde multiplexed-single-cell Agarose Embedded Bisulfite Sequencing (multiplexedscAEBS) für die Methylierungsanalyse von Einzelzellen mittels Bisulfit-Sequenzierung etabliert. Mit multiplexed-scAEBS konnte der Methylierungsstatus der drei EMTassoziierten Genpromotoren miR200c/141, miR200b/a/429 und CDH1 bei einer einzelnen Zelle analysiert werden. Der komplette Workflow wurde an Einzelzellen der Lymphozytenzelllinie GM14667 und der Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und MCF7 getestet und validiert. Anschließend wurde multiplexed-scAEBS an 94 EpCAMpos CTCs von 11 Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom (mBC), 65 EpCAMpos CTCs von sechs Patienten mit kastrationsresistentem Prostatakarzinom (mCRPC) und 30 CD45pos Zellen von drei mBC-Patienten angewendet. Insgesamt konnten abhängig von der jeweiligen Zelllinie 80-90% der Einzelzellen erfolgreich analysiert werden. Die mit multiplexed-scAEBS generierten Einzelzell-Profile der drei EMT-assoziierten Gene der Zelllinien MDA-MB-231 (eher mesenchymaler Phänotyp) und MCF-7 (eher epithelialer Phänotyp) bestätigten die zuvor mit Standardmethoden und hohen DNAAusgangsmengen veröffentlichten Daten. Einzelzellen der eher mesenchymalen Zelllinie MDA-MB-231 zeigten ein hypermethyliertes Metyhlierungsmuster, während bei Einzelzellen der eher epithelialen Zelllinie MCF-7 ein hypomethyliertes Methylierungsmuster beobachtet wurde. Bei der Analyse der CTCs waren die drei EMT-assoziierten Gene hypomethyliert und wiesen Methylierungsmuster auf, welche eher auf einen epithelialen Phänotyp schließen lassen. Jedoch war der Methylierungsstatus der miR200-Familie bei mCRPC-CTCs besonders heterogen, wobei einzelne CTCs Methylierungsprofile zeigten, die auf einen eher mesenchymalen Phänotyp hinweisen. Diese Ergebnisse deuten zum einen auf eine intertumorspezifische, zum anderen auf eine inter-zelluläre Heterogenität bezüglich der epigenetischen Regulation der drei EMT-assoziierten Gene hin, die einzelnen Tumorzellen die dynamische Regulierung der Genexpression von EMT-assoziierten Genen erlaubt. Einige CTCs könnten dabei die epigenetische Regulation von EMTassoziierten Genen für eine Art phänotypisches Feintuning nutzen. Durch die erhobenen Daten konnte das Potenzial von Methylierungsmustern bei CTCs als Biomarker gezeigt werden. Es ist weiter interessant, inwiefern die Methylierungsmuster der miR200-Familie bei CTCs beispielsweise bei der Resistenzbestimmung von Chemotherapien genutzt werden könnten.The epithelial mesenchymal transition (EMT), in which epithelial tumor cells can attain a mesenchymal-like phenotype, is regarded as an important driver of tumor progression and metastasis. In the control of EMT processes, the regulation of EMTassociated genes by DNA methylation appears to be crucial. The methylation analysis of circulating tumor cells (CTCs) enriched and isolated from the blood circulation, which are regarded as potential precursor cells of metastases, opens new possibilities to understand the influence of DNA methylation on EMT. In fact, in most cases only a few CTCs per patient can be enriched and isolated, so that molecular analyses have to be performed with very few cells or even single cells as starting material. Within the scope of this work, multiplexed-single-cell Agarose Embedded Bisulfite Sequencing (multiplexed-scAEBS) was established for the methylation analysis of single cells by bisulfite sequencing. With multiplexed-scAEBS the methylation status of the three EMT-associated gene promoters miR200c/141, miR200b/a/429 and CDH1 could be analyzed in single cells. The complete workflow was tested and validated on single cells of the lymphocyte cell line GM14667 and the breast cancer cell lines MDA-MB231 and MCF-7. Subsequently, multiplexed-scAEBS was applied to 94 EpCAMpos CTCs from 11 patients with metastatic breast cancer (mBC), 65 EpCAMpos CTCs from six patients with castration-resistant prostate cancer (mCRPC) and 30 CD45pos cells from three mBC patients. Depending on the cell line, 80-90% of the single cells from cell lines could be successfully analyzed. The single-cell profiles of the three EMTassociated genes of the cell lines MDA-MB-231 (more mesenchymal-like phenotype) and MCF-7 (more epithelial-like phenotype) generated with multiplexed-scAEBS confirmed the data previously published with standard methods and high DNA starting material. Single cells of MDA-MB-231 were rather hypermethylated while single cells of MCF-7 were hypomethylated. The analysis of the CTCs revealed overall hypomethylation of the three EMT-associated genes and exhibited methylation patterns that were more indicative of an epithelial phenotype. However, the methylation status of the miR200 family was heterogeneous in mCRPC-CTCs with individual CTCs exhibiting methylation profiles indicative of a more mesenchymal-like phenotype. These results might reflect an inter-tumor-specific heterogeneity and an inter-cellular heterogeneity with respect to the epigenetic regulation of the three EMT-associated genes. That might allow individual tumor cells to dynamically regulate the gene expression of EMT-associated genes. Some CTCs could use the epigenetic regulation of EMT-associated genes for a kind of phenotypic fine-tuning. The data collected show the potential of methylation patterns in CTCs as biomarkers. It is also interesting to what extent the methylation patterns of the miR200 family in CTCs could be used in clinical utility to determine the resistance to chemotherapies. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Bezug: | 2013-2020 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Sonstige Einrichtungen/Externe | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.07.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 09.07.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 05.06.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 23.06.2020 |
