Dokument: Murines GBP7 und interagierende Proteine in der Wirtsabwehr
| Titel: | Murines GBP7 und interagierende Proteine in der Wirtsabwehr | |||||||
| Weiterer Titel: | Murine GBP7 and interacting proteins in host defense | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53538 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20210714-104806-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Legewie, Larissa [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | GBPs, mGBPs, Toxoplasma gondii | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Guanylat-bindenden Proteine (GBPs) bilden eine Familie von IFN-induzierbaren GTPasen, die eine Schlüsselrolle in der zellautonomen Immunität gegen intrazelluläre Pathogene wie T. gondii spielen. Vorangegangene Studien konnten zeigen, dass Mitglieder der murinen GBP-Familie direkt an der T. gondii PVM akkumulieren, deren Ruptur vermitteln und somit letztendlich zur Eliminierung des Parasiten bzw. zur Immunkontrolle beitragen. Insbesondere mGBP7 wird eine essentielle Funktion in der Immunabwehr gegen T. gondii zugeschrieben, da mGBP7-/-
-Mäuse ca. an Tag 10 nach einer Infektion mit Typ-II Toxoplasmen versterben, während bei gleicher Infektionsdosis nur ca. 10 – 15 % der WT-Mäuse sterben. Die zu Grunde liegenden biochemischen und molekularen Mechanismen der mGBP7-vermittelten Immunität sind jedoch bisher nur wenig verstanden. Bislang wurden sowohl humanes GBP1 und GBP5 als auch murines GBP2 biochemisch detailliert charakterisiert. Mit murinem GBP7 wird in dieser Arbeit ein mGBP-Familienmitglied mit einem unkonventionellen und verlängerten C-Terminus analysiert. Die vorliegende Studie zeigt, dass mGBP7 eine konzentrationsabhängige GTPase-Aktivität (kcat, app = 20 min-1) aufweist und, dass das Lysin an Position 51 für dessen Enzymaktivität essentiell ist. Fluoreszenzspektroskopische Analysen demonstrieren weiterhin, dass mGBP7 mit hoher Affinität an GTP (KD = 0,22 µM) bindet und die K51A-Mutation die GTP-Bindung stark beeinträchtigt. GTPase-Aktivitätsmessungen belegen, dass vorwiegend GTP als Substrat für die mGBP7-Hydrolysereaktion dient und dass mGBP7 das Nukleotid GTP zu GDP und GMP hydrolysiert. Die Inkubation mit γ-Phosphatanaloga wie Orthovanadat, AlFx und BeFx in Komplex mit GDP führt zu einer Hemmung der GTPase-Aktivität. SEC-MALS- und SAXS-Analysen zeigen zudem, dass mGBP7 transiente Dimere bildet und dass dieses Oligomerisierungsverhalten überraschenderweise nicht durch die Anwesenheit von Nukleotiden beeinflusst wird. Bisher ist nur wenig zu Interaktionen von mGBPs mit anderen zellulären Molekülen beschrieben und vor allem für mGBP7 sind noch keine Protein-Interaktionen bekannt. In dieser Arbeit konnten erstmalig mGBP7-Interaktionspartner mittels Ko-IP- und MS-Analyse ermittelt und anschließend durch unabhängige Ko-IP-Experimente verifiziert werden. Die Ko-IP-Ergebnisse zeigen, dass der Ca2+-sensitive Cl--Kanalregulator Clca1, das in Zellkontakten vorhandene Strukturprotein Jup und das Lipid Raft Protein Rftn1 Interaktionspartner von mGBP7 darstellen. Zudem belegen die unabhängig durchgeführten Ko-IP-Analysen eine spezifische Interaktion von mGBP7 mit dem Synaptotagmin-ähnlichen Protein Sytl2 sowie dem Adaptorprotein Tom1. Mittels Konfokalmikroskopie konnte zusätzlich eine Kolokalisation von mCherry-mGBP7 mit generierten GFP-Fusionskonstrukten von Sytl2 und Tom1 an der T. gondii PV gezeigt werden. Mittels Antikörperfärbung konnte demonstriert werden, dass auch das Hüllprotein Clathrin an exakt denselben Arealen der T. gondii PV akkumuliert wie mGBP7 und Tom1. Des Weiteren konnten im Rahmen der Interaktionsstudien durch WB-Analysen gezeigt werden, dass mGBP7 sowohl in An- als auch in Abwesenheit einer T. gondii-Infektion ubiquitiniert sowie ISGyliert wird. Diese Beobachtungen, zusammen mit der Kolokalisation von mGBP7, Tom1 und Clathrin, lassen die Hypothese zu, dass ein für die Reorganisation von Membranen während der Autophagie erforderliches Tom1-Ubiquitin-„Konjugationssystem“ dafür verantwortlich sein könnte, dass mGBPs als Effektorproteine gezielt auf intrazelluläre Membranen von Pathogenen wie der PVM von T. gondii gelenkt werden. Interessanterweise wurde auch ein T. gondii-Protein, das SAG1-ähnliche SRS29C, in den MS-Analysen als potentieller Interaktionspartner von mGBP7 identifiziert. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die biochemische und funktionelle Charakterisierung von mGBP7 durchgeführt, durch die neue Erkenntnisse zu den molekularen Funktionen dieser GTPase in der Infektabwehr gegen einen intrazellulären pathogenen Parasiten gewonnen werden konnten.Guanylate-binding proteins (GBPs) comprise a family of interferon-inducible GTPases that play a key role in the cell-autonomous immunity against intracellular pathogens such as Toxoplasma gondii (T. gondii). Previous studies have shown that members of the murine GBP (mGBP) family directly accumulate at intracellular T. gondii and by disruption of the parasitophorous vacuole membrane (PVM) mediate killing of the parasite. In particular mGBP7 plays an important role in the innate immune defense against T. gondii, since mGBP7-/- mice die around day 10 post infection with type-II toxoplasma whereas only 10 – 15 % of wildtype mice die. However, the underlying biochemical and molecular mechanisms of the mGBP7-mediated effector functions are poorly understood. So far, human GBP1 and GBP5 as well as murine GBP2 have been biochemically characterized in detail. Here, with murine GBP7, a GBP family member with an unconventional and elongated C-terminus is analyzed. This study demonstrates that mGBP7 exhibits a concentration-dependent GTPase activity (kcat, app = 20 min-1) and that the lysine at position 51 is essential for enzyme activity. In addition, fluorescence spectroscopy analyses reveal that mGBP7 binds GTP with high affinity (KD = 0.22 µM) and that the K51A mutation strongly impairs GTP binding. GTPase activity measurements indicate that mainly GTP serves as substrate for the mGBP7 hydrolysis reaction and that mGBP7 hydrolyzes the GTP nucleotide to GDP and GMP. The mGBP7 GTPase activity is inhibited by incubation with γ-phosphate analogs such as orthovanadate, AlFx and BeFx in complex with GDP. Furthermore, SEC-MALS and SAXS analyses provide evidence that mGBP7 forms transient dimers and that, surprisingly, this oligomerization pattern is not influenced by the presence of nucleotides. To date, only scarce data is available with regard to interactions of mGBPs and, especially for mGBP7, no protein interactions are known yet. In this study, interaction partners of mGBP7 could be identified for the first time by co-immunoprecipitation (co-IP) and mass spectrometry (MS) analysis and were verified by independent co-IP experiments. The co-IP results indicate that the Ca2+-sensitive chloride channel regulator Clca1, the structural protein Jup and the lipid raft protein Rftn1 interact with mGBP7. Furthermore, the independently performed co-IP analyses strongly indicate a specific interaction of mGBP7 with the synaptotagmin-like protein Sytl2 and the adaptor protein Tom1. In addition, confocal microscopy analyses revealed a colocalization of mCherry-mGBP7 with newly generated GFP fusion constructs of Sytl2 and Tom1 at T. gondii PVs. Antibody staining demonstrated that the coat protein clathrin also accumulates at exactly the same areas of the T. gondii PV as mGBP7 and Tom1. Moreover, Western Blot analyses of co-immunoprecipitated mGBP7 showed that the protein is ubiquitinated and ISGylated both in the presence and in the absence of T. gondii infection. This observation, along with the colocalization of the proteins mGBP7, Tom1 and clathrin allows the hypothesis that a Tom1-ubiquitin "conjugation system" required for membrane reorganization during autophagy may be responsible for targeting mGBPs as effector proteins to intracellular membranes of pathogens such as the T. gondii PVM. Interestingly, in MS analyses the SAG1-like T. gondii protein SRS29C was identified as potential interaction partner of mGBP7. In summary, this doctoral thesis focused on the biochemical and functional characterization of mGBP7, which provided new insights into the molecular functions of this GTPase in the host defense against an intracellular pathogenic parasite. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 14.07.2021 | |||||||
| Dateien geändert am: | 14.07.2021 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 05.03.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 08.06.2020 |
