Dokument: OSMAC and Co-Culture Approaches for Diversifying Secondary Metabolites from Endophytic Fungi

Titel:	OSMAC and Co-Culture Approaches for Diversifying Secondary Metabolites from Endophytic Fungi
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53481
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200622-113755-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Moussa, Mariam [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,15 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.06.2020 / geändert 17.06.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Thema der Gewinnung neuer Sekundärmetabolite aus endophytischen Pilzen durch Anwendung verschiedener Kultivierungsmethoden, wie der Kultivierungsansatz nach OSMAC und die Co-Kultivierung, mit dem Ziel ruhende biogenetische Genabschnitte zu aktivieren. Es wurden hierbei auffällige Veränderungen im metabolischen Profil der Mikroorganismen, die Gegenstand dieser Arbeit sind, detektiert. Die Strukturaufklärung der isolierten neuen und bekannten Substanzen wurde mittels ESIMS, HRESIMS, 1D und 2D NMR Spektroskopie durchgeführt. Im Falle von chiralen Substanzen wurde deren absolute Stereochemie durch Vergleich der optischen Rotation mit der Literatur, ECD-Messungen und -Berechnungen, sowie mittels Berechnungen der Rotationsbarrieren bestimmt. Die erhaltenen Substanzen wurden mittels Biotests bezüglich deren antibiotischen und zytotoxischen Profile evaluiert. Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit 29 Naturprodukte aus axenischer Fermentation von Stemphylium globuliferum und gemischten Fermentationen von Fusarium tricinctum isoliert. Von diesen Sekundärmetaboliten konnten acht Substanzen als neue Metabolite beschrieben werden. Die vorliegende Arbeit beinhaltet drei Manuskripte, welche bereits publiziert oder für Publikationszwecke eingereicht wurden: 1. Tetrahydroanthrachinonderivate aus dem mangroven endophytischen Pilz Stemphylium globuliferum Der endophytische Pilz Stemphylium globuliferum wurde aus der mangroven Pflanze Avicennia marina isoliert und auf weißen Bohnen kultiviert. Zwei neue Monomere vom Tetrahydroanthrachinontyp, Altersolanol Q und 10-methylaltersolanol Q, und ein neues Anthranoiddimer, Alterporriol X, wurden aus dem Rohextrakt isoliert. Zusätzlich wurden dreizehn bekannte Substanzen, welche strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen, isoliert und identifiziert. Die absolute Konfiguration der neuen Substanzen wurde mittels TDDFT-ECD Berechnungen und durch Literaturvergleich von gemessenen ECD Spektren bestimmt. Die neuen Substanzen wurden gegen die murine Lymphoma Zellline L5178Y getestet. Diese zeigten keine Aktivität. Und im Vergleich zu strukturähnlichen aktiven Substanzen, wie Altersolanol A, welche ebenfalls aus diesem Extrakt gewonnen wurden, kann dieses Ergebnis zur Klärung des Struktur-Bioaktivitätsverhältnisses herangezogen werden. 2. Co-Kultur des Pilzes Fusarium tricinctum mit Streptomyces lividans induziert die Produktion kryptischer Naphthochinondimere Der endophytische Pilz Fusarium tricinctum wurde aus der Pflanze Aristolochia paucinervis isoliert. Um die Produktion von Sekundärmetaboliten zu erhöhen, wurde der Pilz in einem Experiment mit dem Bodenbakterium Streptomyces lividans co-kultiviert. Die auffällige Veränderung im metabolischen Profil der Co-Kultur im Vergleich zu den axenischen Kulturen wies auf eine Induktion kryptischer Substanzen hin. Chromatographische Auftrennung führte zur Identifizierung von vier neuen Naphthochinondimeren, nämlich Fusatricinone A, B, C and D, und zusätzlich einem Derivat des bioaktiven Lateropyrons, dem Dihydrolateropyron. Durch die Co-Kultur wurde ebenfalls eine bis zu 12-facher verstärkten Produktion der standardmäßig vorhandenen bioaktiven Substanzen erzielt, wie Lateropyron, die Enniatine und das Lipopeptid Fusaristatin A. Ebenfalls hat die Co-Kultivierung die Produktion kryptischer bekannter Substanzen erzielt. Die Strukturen der neuen Substanzen wurden mithilfe von 1D und 2D NMR und HRESIMS aufgeklärt. Die absolute Konfiguration des Dihydrolateropyrons wurde durch TDDFT-ECD bestimmt. Die neuen Substanzen wurden mittels Biotests hinsichtlich der zytotoxischen und antibiotischen Eigenschaften charakterisiert, und zeigten dabei keine Aktivitäten. 3. Co-Kultur des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa mit dem Pilz Fusarium tricinctum induziert bakterielle antipilz und quorum sensing Signalmoleküle Die Co-Kultivierung des Pilzes F. tricinctum mit lebenden humanpathogenen Bakterien, Pseudomonas aeruginosa, führte zur Aktivierung von ruhenden biosynthetischer Genabschnitte des Bakteriums. Die Reaktion des Bakteriums konnte makroskopisch durch Distanzinhibition des Pilzes und tief grüner Verfärbung der Bakterienkolonien festgestellt werden. Die Anhäufung kryptischer Pseudomonaden-Metabolite wurde mittels HPLC Analyse detektiert. Die antimykotischen Substanzen Phenazin-1-carboxylsäure (PCA) und Phenazin-1-carboxylamid (PCN), zusammen mit dem quorum sensing Metabolit 2-Heptyl-4-hydroxychinolon (HHQ), welche bakteriellen Ursprungs sind, wurden während der Co-Kultivierung mit F. tricinctum induziert. Im Gegensatz zu anderen Co-Kultivierungsexperimenten mit F. tricinctum, wie die Co-Kultur des Pilzes mit S. lividans, zeigte sich während der Co-Kultivierung von F. tricinctum mit P. aeruginosa, im Hinblick auf metabolischer Induktion, keine Reaktion des Pilzes. The present thesis focuses on the subject about obtaining new secondary metabolites from endophytic fungi by employing various culture methods, such as the OSMAC approach and co-cultivation, in order to induce silent biogenetic gene clusters. Dramatic shifts in the metabolic pattern of the microorganisms that were subject of this study were detected using these methods. The structures of the isolated new and known compounds were elucidated by ESIMS, HRESIMS and 1D and 2D NMR spectroscopy. In case of chiral compounds their absolute configurations were determined by their optical rotation in comparison to the literature, ECD measurements and calculations, and rotation barrier calculations. Obtained compounds were subjected to bioassays for evaluating their antibiotic and cytotoxic profiles. In summary, 29 natural products were isolated from axenic fermentations of Stemphylium globuliferum and mixed fermentations of Fusarium tricinctum. From these isolated metabolites, eight compounds proved to be new metabolites. This thesis contains three manuscripts which were either already published or submitted for publication: 1. Tetrahydroanthraquinone derivatives from the mangrove-derived endophytic fungus Stemphylium globuliferum The endophytic fungus Stemphylium globuliferum was isolated from the mangrove plant Avicennia marina and cultivated on white beans medium. From the crude extract two new tetrahydroanthraquinone monomers, altersolanol Q and 10-methylaltersolanol Q, and one new anthranoid dimer, alterporriol X, have been isolated. Additionally, thirteen known compounds of same structural characteristics were isolated and identified. The absolute configuration of the new compounds was determined by TDDFT-ECD calculations and by comparison of measured ECD with the literature. The new compounds were tested against the mouse lymphoma cellline L5178Y. Since they are inactive, this finding can contribute to the structure-bioactivity relationship of active known compounds like altersolanol A, also obtained from this extract. 2. Co-culture of the fungus Fusarium tricinctum with Streptomyces lividans induces production of cryptic naphthoquinone dimers The endophytic fungus Fusarium tricinctum was isolated from the plant Aristolochia paucinervis. In order to enhance the production of secondary metabolites, the fungus was subjected to a co-culturing experiment with the soil bacterium Streptomyces lividans. The dramatic shift in the metabolic profile of the co-culture, compared to the axenic cultures, indicated the induction of cryptic compounds. The isolation process resulted in the identification of four new naphthoquinone dimers, fusatricinones A, B, C and D with an additional derivative of the bioactive lateropyrone, dihydrolateropyrone. The co-culture also caused an up to 12-fold upregulation of constitutively present bioactive compounds, like lateropyrone, the enniatins and the lipopeptide fusaristatin A. Furthermore, the co-culture induced the production of known cryptic compounds. The structures of the new compounds were elucidated by using 1D and 2D NMR and HRESIMS. The absolute configuration of dihydrolateropyrone was unambiguously determined by TDDFT-ECD. The new compounds were subjected to bioassays evaluating the cytotoxic and antibiotic activity, showing no activity. 3. Co-culture of the bacterium Pseudomonas aeruginosa with the fungus Fusarium tricinctum induces bacterial antifungal and quorum sensing signalling molecules The co-culture of the fungus F. tricinctum with the viable human pathogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa triggered the activation of silent bacterial biosynthetic gene clusters. The bacterial reaction was seen on a macroscopic level through distance inhibition of the fungus and dark greenish growth of the bacterial colonies. The accumulation of cryptic pseudomonad metabolites was detected via HPLC analysis. The antifungal compounds phenazine-1-carboxylic acid (PCA) and phenazine-1-carboxylic amide (PCN), along with the quorum sensing metabolite 2-heptyl-4-hydroxy-quinolone (HHQ), which are of bacterial origin, were induced during co-cultivation with F. tricinctum. In contrast to other co-culture experiments employing F. tricinctum, such as the co-culture of the fungus with S. lividans, no fungal reaction in terms of metabolite induction was observed during co-cultivation of F. tricinctum with P. aeruginosa.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie
Dokument erstellt am:	22.06.2020
Dateien geändert am:	22.06.2020
Promotionsantrag am:	20.01.2020
Datum der Promotion:	06.05.2020