Dokument: Charakterisierung der Redoxsensitivität und Funktion des macrophage capping protein (CAPG) in humanen Glioblastomzelllinien
| Titel: | Charakterisierung der Redoxsensitivität und Funktion des macrophage capping protein (CAPG) in humanen Glioblastomzelllinien | |||||||
| Weiterer Titel: | Characterization of the redox sensitivity and function of the macrophage capping protein (CAPG) in human glioblastoma cell lines | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53469 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20200617-134347-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Prescher, Nina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Stühler, Kai [Gutachter] Prof. Dr. Jahns, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das humane Protein CAPG (macrophage capping protein) ist 38,5 kDa groß und gehört zur Gelsolin /Villin Familie aktinbindender Proteine. Durch seine Ca2+ abhängige aktinblockierende Eigenschaft wird die Aktindynamik reguliert und dadurch die Zellmotilität moduliert. Bei verschiedenen Tumorentitäten wie z. B. dem Glioblastom wurde bereits eine CAPG Überexpression mit einer erhöhten Invasivität und Migration assoziiert. Erste Hinweise deuten zudem darauf hin, dass es sich bei CAPG um ein redox sensitives Protein handeln könnte. Somit stand die genauere Charakterisierung von CAPG als redox sensitives Protein im Fokus dieser Arbeit.
• Die Behandlung von A172 Glioblastomzellen mit Wasserstoffperoxid führte zur Identifizierung von CAPG als eines von 382 redox sensitiven Proteinen nach Anreicherung über eine Thiopropyl Sepharose Matrix. • Im Rahmen dieser Arbeit wurde das PEG Switch Protokoll erfolgreich für die weitere Charakterisierung des Redoxstatus von CAPG etabliert. Die detektierte Molekulargewichtsverschiebung deutet darauf hin, dass zwei der fünf Cysteine von CAPG sensitiv für die Oxidation sind. • Mit Hilfe des differenziellen massenspektrometriebasierten Markierungsexperiments konnten die beiden Cysteine, C282 und C290, von CAPG in den unbehandelten Proben positionsgenau als reversibel oxidiert nachgewiesen werden. Wohingegen es unter Wasserstoffperoxidbehandlung zu einer Überoxidation zu einer Sulfin (SO2H) oder Sulfonsäure (SO3H) zu kommen scheint. Mittels zielgerichtetem PRM Experiment wurde eine Trioxidation an dem Cystein C290 nachgewiesen. Der mögliche funktionelle Einfluss der oxidativen posttranslationalen Modifikationen sollte im Folgenden geklärt werden. • In Scratch Assays konnte erstmals gezeigt werden, dass die beiden Cysteinmutanten C282S und C290S von CAPG das Migrationspotenzial der LN18 Zellen inhibieren. Überdies konnte mit Hilfe der Cysteinmutanten gezeigt werden, dass keines der Cysteine von CAPG einen signifikanten Einfluss auf die kanonische Aktin Capping Funktion von CAPG hat. Dessen ungeachtet ist die Lokalisation von CAPG jedoch redox abhängig und nach Wasserstoffperoxidbehandlung verringert sich die CAPG Menge im Kern. Außerdem zeigte die Analyse der subzellulären Lokalisation von CAPG in menschlichem Tumorgewebe eine heterogene CAPG Verteilung, die in verschieden gradigen Gliomen kein klares Muster zeigte. • Mittels einer Interaktomstudie konnte eine weitere zelluläre Funktion, in Form einer möglicherweise redox abhängigen Beteiligung an Adhäsionskomplexen, postuliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde CAPG als redox sensitives Protein in humanen Glioblastomzelllinien umfassend charakterisiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die beiden Cysteine, C282 und C290, dabei eine relevante Rolle für die Proteinfunktion spielen. Dabei deuten die Daten daraufhin, dass CAPG in Abhängigkeit seines Redoxzustandes an der Ausbildung von Adhäsionskomplexen beteiligt ist und dass dies zu einem gesteigerten Migrationspotenzial der Zellen führen könnte.The human macrophage capping protein (CAPG) is a 38.5 kDa actin filament capping protein of the gelsolin/villin family of actin binding proteins. Due to its Ca2+ dependent actin blocking property, actin dynamics are regulated and thereby cell motility is modulated. In a number of tumors such as glioblastoma a CAPG overexpression has already been associated with increased invasiveness and migration. Preliminary studies suggested CAPG as a potential redox sensitive protein. The aim of this work was the detailed characterization of CAPG as a redox sensitive protein. • The hydrogen peroxide treatment of A172 glioblastoma cells led to the identification of CAPG as one of 382 redox-sensitive proteins after enrichment via a Thiopropyl Sepharose matrix. • As part of this work the PEG switch protocol was successfully established for a further characterization of the redox status of CAPG. The detected molecular weight shift indicates that two of the five CAPG cysteines are sensitive to oxidation. • With the differential mass spectrometry based labeling experiment the two cysteines, C282 and C290, of CAPG could be detected as reversibly oxidized in the untreated samples. Whereas an overoxidation to a sulfinic (SO2H) or sulfonic acid (SO3H) occurs as a result of the hydrogen peroxide treatment. Additionally, a trioxidation was detected on the cysteine C290 in a targeted parallel reaction monitoring experiment. However, the possible functional impact of the oxidative posttranslational modifications should be further validated. • It was shown for the first time that the two cysteine mutants, C282S and C290S, inhibit the invasion potential of the LN18 cells in scratch assays. But however, the cysteines of CAPG had no significant influence on the canonical actin capping function of CAPG. Using the cysteine mutants, it could be shown that the subcellular localization of CAPG is redox-dependent and that the amount of CAPG in the nucleus decreases after hydrogen peroxide treatment. Furthermore, the analysis of the subcellular localization of CAPG in human tumor tissue showed a heterogeneous CAPG distribution showing no clear pattern in different glioma grades. • With the results from the interactome studies another cellular function for CAPG could be postulated in form of a possibly redox-dependent involvement in adhesion complexes. This work extensively contributes to the comprehensive characterization of CAPG as a redox sensitive protein in human glioblastoma cell lines. It was shown that the two cysteines, C282 and C290, play a relevant role for protein function and regulation. Additionally, the data indicates that CAPG is involved in the formation of adhesion complexes depending on its redox state and that this could lead to an increased migration of the cells. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 17.06.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 17.06.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.04.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 10.06.2020 |
