Dokument: Understanding molecular mechanism and structural properties of small GTPase mediated-effector activation

Titel:	Understanding molecular mechanism and structural properties of small GTPase mediated-effector activation
Weiterer Titel:	Verständnis des molekularen Mechanismus und der strukturellen Eigenschaften der durch kleine GTPasen vermittelten Effektoraktivierung
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53324
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210713-105207-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Rezaei Adariani, Soheila [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 51,12 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.06.2020 / geändert 02.06.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Ahmadian, Reza [Gutachter] Prof. Dr. Seidel, Claus [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die RAS- und RHO-Familien der kleinen GTPasen sind wichtige Elemente der Signaltransduktion, die verschiedene biologischen Funktionen steuern, wie Apoptose, Migration, Stoffwechsel, Kontraktion, Proliferation und Differenzierung. Eine abnormale Aktivierung kleiner GTPasen verursacht verschiedene Erkrankungen, wie zum Beispiel Krebs, neurologische Störungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. GTPasen fungieren als molekulare Schalter und interagieren mit einer Vielzahl von Effektor-Proteinen. Der molekulare Mechanismus der Effektor-vermittelten Aktivierung dieser Superfamilie ist noch nicht gut verstanden. Die Ziele dieser Dissertation sind es, neue Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der Effektor-Aktivierung durch RAS/RHO GTPasen und ihre Interaktion mit verschiedenen Effektoren zu gewinnen. Das Verständnis der molekularen Mechanismen zur Aktivierung kleiner GTPase-Effektoren und die damit verbundene Identifizierung neuer Zielproteine ist wichtig für die Entwicklung von zielgerichteten Medikamenten, die Signalwege abschwächen, anstatt sie zu hemmen. Im ersten Teil der Doktorarbeit wurde die Interaktion zwischen der RAS Association (RA) Domain Family (RASSF) und verschiedenen Mitgliedern der RAS-Familie analysiert. Die Mitglieder der RASSF-Familie wirken als nicht-enzymatische Effektoren und sind mutmaßliche Tumorsuppressoren, die bei Krebserkrankungen häufig herunterreguliert werden. Diese Familie lässt sich in zwei Gruppen unterteilen, RASSF1-6 als erste Gruppe und RASSF7-10 als zweite Gruppe. Allerdings ist der Interaktionsmechanismus zwischen RASSF und RAS-Proteinen unklar. Mit Hilfe der Fluoreszenzpolarisation wurden Gleichgewichtsdissoziationskonstanten für ihre Wechselwirkungen bestimmt. Die quantitativen Ergebnisse in Kombination mit in silico-Modellierung wiesen auf eine Interaktionsselektivität zwischen verschiedenen RAS-Proteinen und einigen Mitgliedern dieser Effektor-Familie hin, insbesondere RASSF1 und RASSF5. Wir fanden generell heraus, dass die RASSF Gruppe eins eine höhere Bindungsaffinität mit verschiedenen RAS-Proteinen aufwies als Gruppe zwei. In diesem Kontext zeigten RASSF1- und RASSF5-Proteine aus der ersten Gruppe die höchsten Bindungsaffinitäten und Sequenzähnlichkeiten in ihrer Interaktion mit ausgewählten RAS-Proteinen. Im zweiten Teil haben wir die Struktur und der molekulare Mechanismus des ROCK-Proteins, eines Effektors für das RHO-Familienmitglied RHOA untersucht. Dieses Protein ist ein wesentlicher Regulator des Aktin-Zytoskeletts und der Stressfaserbildung, ist an verschiedenen Stadien von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt und bietet sich damit als neue therapeutische Zielstruktur an. Die Struktur-Funktionsbeziehung der ROCK-Aktivierung durch RHOA ist nicht vollständig verstanden. Die Arbeit gibt strukturelle Einblicke in ein ausgestrecktes, parallel angeordnetes Dimer aus aufgereinigtem, volllängen ROCK mittels Elektronenmikroskopie. Im Detail wurde die Aktivität dieses Proteins überprüft. Hierbei wurde die Phosphorylierung des Substrates MYPT1 in Anwesenheit und Abwesenheit von RHOA mit Hilfe eines Kinase-Assay gemessen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass das gereinigte ROCK voll aktiv ist und das Vorhandensein von RHOA seine Aktivität nicht weiter erhöht. Im zellulären Kontext könnten jedoch Scaffold-Proteine mechanistisch die ROCK-Autoinhibition modulieren. Im dritten Teil wurde die Interaktion der RHO GTPasen, RAC1 und RHOA, mit der Homologie-Region 1 (HR1) a, b und c der Proteinkinase N (PKN) untersucht. PKN ist ein Schlüsseleffektor, der an der Reorganisation des Zytoskeletts und der Migration beteiligt ist. Unsere Daten zeigen, dass die HR1-Domänen von PKN (HR1a-c) trotz hoher Sequenzähnlichkeiten unterschiedliche Bindungseigenschaften für RAC1 und RHOA aufweisen. Möglicherweise kontrollieren die RHO-Proteine durch ihre unterschiedliche Bindungsaffinitäten die Konformationsänderung und damit einhergehende Aktivierung von PKN. Schließlich umfasst der letzte Teil eine kurze Zusammenfassung von drei Papieren, die sich auf umfassende Studien über Proteine der RAS-Familie, RAF-Struktureigenschaften und RRAS2-Mutationen konzentrierten, die ein Noonan-Syndrom-Erkrankung verursachen.   RAS and RHO families of small GTPases are vital elements of signal transduction, which control different biological functions, such as polarity, adhesion, contraction, migration, and differentiation. Abnormal activation of small GTPases cause different diseases, including cancer, neurological disorders, and cardiovascular diseases. These proteins, which act as molecular switches, interact with a variety of effector proteins in their active GTP-bound form and consequently control diverse signaling pathways and biological functions. The molecular mechanism of effector-mediated activation of this superfamily is still not well understood. The aims of this dissertation were to obtain new insight into yet unresolved questions regarding effector activation by RAS/RHO GTPases, and the interaction selectivity of a variety of effectors for different GTPases. Deciphering new functional mechanisms and refining novel targets are important for development of selective drugs, which attenuate signal transduction pathways rather than inhibiting them. In the first part of this dissertation, we investigated the interaction between RAS association (RA) domain family (RASSF), and different members of the RAS family, such as HRAS, RRAS, RHEB, RALA, RAP1B, and RAP2A. The RASSF family act as non-enzymatic effectors, known as putative tumor suppressors, which are frequently downregulated in cancers. This family contains two groups including RASSF1-6 as group one and RASSF7-10 as group two. However, the mechanism of interaction between this family and RAS proteins is still not clear. By using fluorescence polarization, equilibrium dissociation constants for their interaction were determined. Obtained quantitative results in combination with in silico modeling led to the determination of interaction selectivity between different RAS proteins and some members of this effector family, particularly RASSF1 and RASSF5. We found that RASSF group one has higher binding affinities with different RAS proteins as RASSF group two. Especially, RASSF1 and RASSF5 proteins revealed highest binding affinities and sequence similarities among RASSF members in interaction with selected RAS proteins. In the second part of this thesis, we studied the structure and activation mechanism of ROCK, an effector for the RHO family member RHOA. This protein is an essential regulator of the actin cytoskeleton and stress fiber formation, and is involved in different stages of cardiovascular diseases and is thus a therapeutic drug target. This dissertation provided structural insight into an elongated parallel dimer of purified ROCK full-length protein via electron microscopy. Its kinase activity in phosphorylating its substrate MYPT1 was studied in depth in presence and absence of RHOA. Results suggested that purified ROCK is fully active independent of RHOA. However, we proposed that scaffold proteins might mechanistically modulate ROCK autoinhibition in the cellular context. In the third part, the interaction of the RHO GTPases, RAC1 and RHOA, with the homology region 1 (HR1) a, b and c of the protein kinase N (PKN) was investigated. PKN is a key effector protein involved in cytoskeleton reorganization and migration. The data indicated that HR1 domains of PKN proteins (HR1a-c) exhibit, in spite of high sequence similarity, different binding properties for RAC1 and RHOA. Therefore, the combination of their binding to RHO proteins appears to control the conformational change and subsequent activation of PKN. Finally, last part covers a short summary of three papers which focused on comprehensive studies over RAS family proteins, RAF structural properties, and RRAS2 mutations which cause a Noonan syndrome disease.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II
Dokument erstellt am:	13.07.2021
Dateien geändert am:	13.07.2021
Promotionsantrag am:	23.09.2019
Datum der Promotion:	06.05.2020