Dokument: Die Rolle des Gallensalzrezeptors TGR5 (GPBAR1) in gastrointestinalen Tumoren

Titel:	Die Rolle des Gallensalzrezeptors TGR5 (GPBAR1) in gastrointestinalen Tumoren
Weiterer Titel:	Role of the bile acid receptor TGR5 (GPBAR1) in gastrointestinal tumors
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=53313
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210623-084809-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Deutschmann, Kathleen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 451,99 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 29.05.2020 / geändert 29.05.2020
Beitragende:	Prof. Dr. med. Keitel-Anselmino, Verena [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Gallensäuren (GS) werden kanzerogene Effekte im Gastrointestinaltrakt zugeschrieben und können insbesondere zur Entstehung kolorektaler Karzinome ( CRC ) beitragen. Bei Patienten mit CRC wurden erhöhte Konzentrationen sekundärer GS wie DCA im Serum und Stuhlgang nachgewiesen. TGR5 ist ein plasmamembranständiger GS-Rezeptor, der im Darm und der Leber exprimiert wird und insbesondere durch sekundäre GS aktiviert wird. Im Darm ist TGR5 in Epithelzellen der Darmmucosa sowie in Makrophagen, enterischen Nervenzellen und Muskelzellen nachweisbar. Dort reguliert er neben der Darmmotilität die Hormonsekretion und moduliert außerdem die Immunantwort in Makrophagen. Ob und inwiefern TGR5 möglicherweise zur CRC-Entstehung beiträgt, war Gegenstand dieser Arbeit. Im ersten Teil der Arbeit wurden Gewebeproben von CRC-Patienten und verschiedene humane CRC-Zelllinien untersucht. Im CRC-Gewebe fand sich eine hohe TGR5-Proteinmenge und der Rezeptor konnte überwiegend in Zellen epithelialen Ursprungs lokalisiert werden. In humanen CRC-Zelllinien war TGR5 unterschiedlich stark exprimiert (HT 29 > CACO 2 > LoVo), wobei die Expressionsstärke mit dem Grad der Differenzierung der Zellen korrelierte. Die Aktivierung von TGR5 mit GS und einem TGR5-spezifischen Agonisten hatte eine Steigerung der Proliferation, der Migration und der Toleranz gegenüber hohen GS-Konzentrationen ausschließlich in TGR5-exprimierenden Zelllinien zur Folge. Diese GS-Effekte waren in HT-29-Zellen, bei denen mittels CRISPR/Cas9 ein TGR5-Knockout induziert wurde, aufgehoben. Diese Befunde suggerieren, dass TGR5 eine Rolle in der CRC-Pathogenese spielen könnte. Um diese These zu überprüfen, wurden nach einem publizierten CRC-Modell TGR5-Wildtyp ( WT )- und TGR5-Knockout ( KO )-Mäuse für 10 Monate mit Deoxycholsäure (DCA, 0,2 %) angereicherter Nahrung gefüttert. Entgegen der in der Literatur beschriebenen Beobachtungen wurden durch DCA keine Darmtumore induziert, was vermutlich auf den verwendeten Mausstamm und das damit unterschiedliche intestinale Mikrobiom zurückzuführen war. Die WT-Tiere nahmen bei Placebofütterung stark an Gewicht zu, ein Effekt, der durch DCA-Gabe auf das Niveau der TGR5-KO-Tiere reduziert wurde. Histologisch fand sich bei den Placebo-WT-Tieren das Bild einer nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH), die durch DCA-Fütterung verhindert wurde. Die TGR5-KO-Tiere waren dagegen unabhängig von der Behandlung vor einer übermäßigen Gewichtszunahme und einer NASH-Entwicklung geschützt. Interessanterweise führte DCA-Fütterung bei 41,7 % der TGR5-WT-Tiere zur Entwicklung hepatozellulärer Karzinome, die sich weder in den Placebo-WT-Tieren noch in den TGR5-KO-Tieren fanden. Im Gegensatz zu TGR5-KO-Tieren bewirkte DCA in den WT-Tieren eine gesteigerte Proliferation von Hepatozyten, nicht aber von Cholangiozyten. Die Lebern der TGR5-KO-Tiere wiesen histologisch und auf Transkriptionsebene eine gesteigerte Fibroseentwicklung und Inflammationsreaktion auf. In der Leber ist TGR5 hauptsächlich in Kupffer-Zellen, in Sinusendothelzellen und in Cholangiozyten lokalisiert, wo er immunmodulierende und choleretische Effekte hat sowie die Mikrozirkulation beeinflusst. Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe ergaben, dass humane Cholangiokarzinome (CCC) eine hohe TGR5-Expression aufweisen und der Rezeptor in CCC-Zellen pro-proliferativ und anti-apoptotisch wirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die humanen CCC-Zelllinien EGI-1 und TFK-1 auf tumorförderliche Funktionen von TGR5 hin untersucht. TGR5 ist hauptsächlich in der apikalen Plasmamembran sowie in Primärzilien lokalisiert. Die Aktivierung in den CCC-Zellen förderte die Proliferation über einen ROS-cSrc-EGFR-ERK-Signalweg sowie die Migrations- und Invasionsaktivität der CCC-Zellen. Ein TGR5-Knockdown mittels siRNA sowie CRISPR/Cas9-vermittelte Editierung konnten diese Effekte in TFK-1-Zellen unterbinden. Die Daten konnten im Zuge dieser Arbeit publiziert werden. Eine computerbasierte Modellierung des CRISPR/Cas9-trunkierten Rezeptors lässt vermuten, dass die Deletion in der Transmembrandomäne 3 durch Okklusion der Rezeptor-Bindetasche zu einem vollständigen Funktionsverlust des weiterhin detektierbaren TGR5-Rezeptors führt. TGR5 war darüber hinaus von Bedeutung für die HCC-Entstehung im DCA-Fütterungsmodell. Aktivierung von TGR5 förderte in den hier untersuchten Zelllinien die Proliferation, die Resistenz gegenüber hohen GS-Konzentrationen sowie die Migration und Invasion, weshalb er zur Tumorgenese bzw. zur Progression von Tumoren im Darm und in der Leber beiträgt. Aus diesem Grund stellt der TGR5-Rezeptor, insbesondere die Entwicklung antagonistisch wirksamer Substanzen, einen interessanten Ansatzpunkt für die therapeutische Intervention von Kolon- und Leberkarzinomen dar. Zum Zweck zukünftig weiterführender Analysen wurde zunächst an primären intra- sowie extrahepatischen Cholangiozyten der Maus die 3-dimensionale Organoidkultur etabliert. Erste Untersuchungen belegten den cholangiozytären Charakter sowie eine funktionelle Polarisierung der Zellen, die einen gerichteten Transport von GS ermöglichte. Die Organoide rekapitulierten die für Cholangiozyten spezifische Expression verschiedener Transportproteine sowie von Primärzilien. Diese Ergebnisse stellen die Grundlage für zukünftige Analysen zur Funktion von TGR5 in biliären Epithelzellen und CCC-Zellen sowie dem Zusammenwirken mit weiteren GS-Rezeptoren wie dem S1PR2 dar. Bile acids (BAs) have been reported to have carcinogenic properties in the gastrointestinal tract and seem to contribute to colorectal carcinoma (CRC) development. In line with this, secondary BA concentrations, especially deoxycholic acid (DCA), were found to be elevated in serum and faeces of CRC patients. The G-protein-coupled receptor TGR5 is a plasma membrane-bound receptor that is responsive to secondary BAs and is expressed in various organs with the highest expression in liver and intestine. In the colon, TGR5 is detectable in epithelial cells, macrophages, glial cells and neurons of the enteric nervous system as well as in smooth muscle cells. Here, it regulates colonic motility, hormone secretion and immunity. The aim of the thesis was to unravel the role of TGR5 for CRC development. Within the first part of this thesis, tissue samples from CRC patients and different human CRC cell lines were analyzed. CRC tissue samples showed high TGR5 protein levels and localization of TGR5 in cells of epithelial origin. Different TGR5 expression levels in human CRC cell lines correlated with the degree of differentiation (HT 29 > CACO 2 > LoVo). Activation of TGR5 by BAs and a specific agonist induced proliferation, migration and resistance to high BA concentrations exclusively in TGR5 high expressing CRC cell lines and were abrogated through CRISPR/Cas9 mediated TGR5 knockout in HT-29 cells. Together, these findings suggest an involvement of TGR5 in CRC development. To further investigate this hypothesis, TGR5 wildtype ( WT ) and TGR5 knockout ( KO ) mice were fed with a 0,2 % DCA enriched diet for 10 months, which is described in the literature as CRC model. Contrary to the literature, DCA failed to induce colon tumors in our mice. This finding may be attributed to the use of different mouse strains and different intestinal microbiota. WT mice fed the placebo diet gained significantly more body weight than DCA fed WT mice. Histologically, livers of placebo fed WT mice showed characteristics of nonalcoholic steatohepatitis (NASH), which were absent in DCA fed WT littermates. In contrast, TGR5 KO mice were protected from excessive weight gain and NASH irrespective of diet (placebo vs. DCA). Interestingly, 41,7 % of TGR5 WT mice developed hepatocellular carcinomas in response to DCA feeding. No HCCs were observed either in placebo WT or TGR5 KO mice. In contrast to TGR5 KO mice, DCA induced proliferation in hepatocytes but not cholangiocytes in WT mice. Histologically and at transcriptional level TGR5 KO livers showed signs of fibrosis development and increased inflammation. In the liver TGR5 is mainly localized in Kupffer cells, sinusoidal cells and cholangiocytes where it mediates immune suppressive and choleretic effects and regulates microcirculation. Preliminary work in our group revealed a strong TGR5 expression in human cholangiocarcinoma (CCA) where it promotes pro-proliferative and anti-apoptotic functions. In the second part of this work human CCA cell lines EGI-1 and TFK-1 were analyzed to unravel the role for TGR5 in CCA progression. TGR5 was mainly localized at the apical plasma membrane and primary cilia. Receptor activation triggered CCA cell proliferation through ROS-cSrc-EGFR-ERK signalling and enhanced migration and invasion. Knockdown of TGR5 using siRNA and CRISPR/Cas9-mediated TGR5 editing suppressed these effects and the results were published in the course of this work. Computational modelling of the CRISPR/Cas9-truncated TGR5 receptor variant revealed, that deletion within transmembrane domain 3 resulted in the occlusion of the binding pocket. This may lead to a complete functional loss of the still expressed TGR5 receptor. Taken together, TGR5 plays a role in HCC development in the DCA mouse model and in the analyzed tumor cell lines TGR5 promotes cell proliferation, BA resistance, migration and invasion, uncovering a role for TGR5 in colon and liver tumorigenesis and/or progression. Thus, inhibition of TGR5 function (development of a TGR5 antagonist) may prove useful as potential therapeutic intervention for carcinomas of the colon and liver. In view of prospective experiments, a 3-dimensional organoid culture system was established using primary murine intrahepatic and extrahepatic cholangiocytes. These organoids recapitulated the cholangiocyte specific expression of polarized proteins as well as primary cilia and showed directional transport activity. These results represent the basis for future investigations to the particular role of TGR5 in biliary epithelial cells and CCA cells as well as the crosstalk with other BA receptors such as S1PR2.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	23.06.2021
Dateien geändert am:	23.06.2021
Promotionsantrag am:	04.12.2019
Datum der Promotion:	11.05.2020