Dokument: Transkriptomweite Identifizierung von Ziel-Transkripten des endosomalen mRNPs mittels iCLIP in Ustilago maydis

Titel:Transkriptomweite Identifizierung von Ziel-Transkripten des endosomalen mRNPs mittels iCLIP in Ustilago maydis
Weiterer Titel:Transcriptome-wide identification of target transcripts of endosomal mRNPs in Ustilago maydis using iCLIP
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20200505-114636-4
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor:Dr. Olgeiser, Lilli [Autor]
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Dateien vom 28.04.2020 / geändert 28.04.2020
Stichwörter:Ustilago maydis, mRNA Langstreckentransport, RNA-bindende Proteine, iCLIP, Endosom
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:RNA-bindende Proteine (RBPs) sind an der zeitlichen und räumlichen Regulation der Gen-expression beteiligt, in dem sie u. a. den mRNA Transport und die lokale Translation post-transkriptionell kontrollieren. Im phytopathogenen Pilz Ustilago maydis ist der morphologische Wechsel vom hefeartigen zum hyphalen und unipolaren Wachstum Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion der Wirtspflanze. Die Etablierung und Aufrechterhaltung des unipolaren Hyphenwachstums hängt vom Mikrotubuli-vermittelten endosomalen Langstreckentransport der mRNAs ab. Die Schlüsselrolle spielt bei diesem Prozess das RBP Rrm4. Der Verlust von rrm4 führt zur Reduktion des hyphalen Wachstums und damit einhergehend zu einer verminderten Virulenz. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es die mRNAs, die von Rrm4 und von dem putativen Rrm4 Interaktionspartner, Grp1B, gebunden werden, mit Hilfe der iCLIP (individual nucleotide resolution in vivo UV-crosslinking and immunoprecipitation) Methode zu identifizieren. Zusätzlich sollte Grp1B als Rrm4 Interaktionspartner bestätigt und charakterisiert werden.
Die Charakterisierung von Grp1B zeigte, dass Grp1B wichtig für beide Wachstumsformen ist und an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist. Grp1B wird für die Koordination des Längenwachstums benötigt und ist involviert in der Kälte- und Zellwandstressantwort. Kolokalisationsstudien zeigten, dass Rrm4 und Grp1B auf sich bewegenden Endosomen kolokalisieren. Dabei zeigte sich, dass die endosomale Lokalisation von Grp1B von den mRNAs abhing die von Rrm4 gebunden wurden. Im Vergleich zu Rrm4, das eine Kernkomponente des endosomalen mRNPs ist, wurde Grp1B somit als akzessorische Komponente des Rrm4-vermittelten mRNA Transports klassifiziert.
Für die Ermittlung der mRNAs wurde die iCLIP Methode verwendet. Das optimierte iCLIP Protokoll ermöglichte die transkriptomweite Identifizierung der Transkripte die von den beiden endosomalen RBPs, Rrm4 und Grp1B, gebunden werden. Die vergleichende Analyse zeigte, dass beide RBPs gemeinsam eine Vielzahl funktionell diverser mRNAs binden. Die ermittelten mRNAs kodieren z. B. für mitochondriale Proteine, für Proteine des Membran-assoziierten Transports sowie Proteine des Zytoskeletts. Diese funktionelle Vielzahl zeigt, dass der Rrm4-vermittelte mRNA Transport eine globale Rolle in der U. maydis Hyphe einnimmt. Entsprechend der nukleär-zytoplasmatischen Lokalisation von Grp1B wurden für Grp1B Ziel-mRNAs identifiziert, die für Zellkernproteine kodieren. Beide RBPs binden einen großen Teil der mRNAs gemeinsam und zwar bevorzugt in der 3´ UTR. Die hohe Auflösung der iCLIP Daten zeigte, dass Rrm4, anders als Grp1B, spezifische Transkripte am Startkodon, im ORF und/oder am Stoppkodon bindet, was auf eine regulatorische Funktion der Translation während des endosomalen Transports hindeutet. Im Gegensatz zu Grp1B konnte für Rrm4 das Bindemotiv UAUG identifiziert werden, welches im ORF angereichert vorliegt und vermutlich von der dritten RRM Domäne erkannt wird.
Die Ergebnisse dieser Arbeit geben zum ersten Mal einen umfangreichen Einblick in die Organisation zweier RBPs eines endosomalen mRNPs und deuten auf eine enge Verbindung zwischen mRNA Transport und Translation hin.

RNA-binding proteins (RBPs) participate in spatial and temporal gene regulation by controlling mRNA transport and local translation. A prerequisite for infection of a host plant by the phytopathogenic fungus Ustilago maydis is the morphological switch from yeast-like to unipolar hyphal growth. Microtubule-dependent endosomal long distance mRNA transport was shown to be crucial for the establishment and maintenance of filamentation and polar growth. The key component of this transport process is the RBP Rrm4. Loss of rrm4 leads to impaired hyphal growth and thus reduced virulence. The goal of this thesis was to identify those mRNAs which are bound by Rrm4 as well as by a putative Rrm4 interacting partner, Grp1B, using the iCLIP (individual nucleotide resolution in vivo UV-crosslinking and immunoprecipitation) method. An additional aim was the confirmation of Grp1B as a Rrm4 interacting partner and the characterization of Grp1B.
The characterization of Grp1B revealed that Grp1B is important for yeast and hyphal growth and is involved in a multitude of biological processes. Grp1B is crucial for the coordination of the correct cell size and is involved in cold as well as cell wall stress response. Co-localization studies showed that Rrm4 and Grp1B co-localize on moving endosomes, whereas the localization of Grp1B depends on the ability of Rrm4 to bind mRNAs. In comparison to Rrm4, which is a core component of endosomal mRNPs, Grp1B was classified as an accessory component of Rrm4-mediated mRNA transport.
The iCLIP technique was used to identify the target mRNAs. Using the improved iCLIP protocol, it was possible to identify the target transcripts of the endosomal RBPs, Rrm4 and Grp1B, at a transcriptome wide level. The iCLIP data shows that both endosomal RBPs bind numerous target mRNAs encode for a multitude of functionally diverse proteins, such as mitochondrial proteins and proteins associated with membrane transport and cytoskeleton. This functional diversity implicates that Rrm4-mediated mRNA transport plays a global role in U. maydis hyphae. In accordance with the nucleo-cytoplasmic localization of Grp1B, target mRNAs were identified within the iCLIP data, which are responsible for encoding the nuclear proteins. Both RBPs bind a large number of shared cargo transcripts, predominantly in the 3´ UTR. Unlike Grp1B, Rrm4 binds at start codon, in the ORF and/or at stop codon, implicating involvement of translational regulation during endosomal transport. Furthermore, a binding motif UAUG was found to be enriched in the ORF and required for the interaction with the third RRM domain of Rrm4.
The results of this thesis provide for the first time a comprehensive insight into the organization of two RBPs of endosomal mRNPs and implicate a close link between mRNA transport and translation.
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:05.05.2020
Dateien geändert am:05.05.2020
Promotionsantrag am:02.10.2019
Datum der Promotion:24.01.2020
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